染料木素對(duì)Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、染料木素（Genistein，Gen）是大豆異黃酮苷元的主要成份之一，廣泛存在于豆科植物中。染料木素因其結(jié)構(gòu)與雌激素類似，故被稱為植物雌激素，具有弱雌激素樣作用和抗雌激素活性。對(duì)腫瘤、心血管疾病、骨質(zhì)疏松及更年期癥狀等均具有防治作用，并且可以提高機(jī)體的免疫功能，其廣泛應(yīng)用于制藥、營養(yǎng)保健品等領(lǐng)域。有研究表明，染料木素對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用，對(duì)AD等神經(jīng)系統(tǒng)退行性病有一定的防治作用。本課題的前期研究發(fā)現(xiàn)，染料木素可作用于海馬神經(jīng)細(xì)胞

2、，通過蛋白激酶C(Protein kinase C，PKC)信號(hào)通路上調(diào)α-分泌酶活性的和下調(diào)β-分泌酶活性，降低不溶性β-淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)片段的形成與沉積，從而抑制Aβ對(duì)海馬神經(jīng)細(xì)胞的毒性，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。本論文將繼續(xù)在細(xì)胞水平就染料木素的細(xì)胞保護(hù)作用及其分子機(jī)制作進(jìn)一步的研究。具體內(nèi)容如下：
　　1.以Aβ25-35毒素誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷，構(gòu)建細(xì)胞損傷模型，用不同濃度的Gen預(yù)處理2h后，再加入Aβ2

3、5-35繼續(xù)孵育24h，形態(tài)學(xué)方法和MTT法檢測(cè)PC12細(xì)胞形態(tài)變化和存活率；Hoechst33342/PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡并計(jì)算凋亡率；分光光度法檢測(cè)Caspase-3活性；鈣離子熒光探針Fluo-3/AM和熒光分光光度計(jì)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，從而探討Gen對(duì)PC12的保護(hù)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Aβ25-35對(duì)PC12細(xì)胞的毒性作用有明顯的劑量依賴性，隨著Aβ濃度的增加，其損傷作用增強(qiáng)，20μmol/L Aβ25-35作用于PC12細(xì)胞2

4、4h后可構(gòu)建細(xì)胞損傷模型；25μmol/L的Gen能減輕Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞形態(tài)損傷；提高細(xì)胞存活力；減少細(xì)胞凋亡率；降低Caspase-3活性及抑制細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，表明Gen對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。
　　2.將PKC抑制劑（Myristoylated Protein Kinase C Peptide Inhibitor，Myr)終濃度為50μmol/L預(yù)給藥1h，阻斷PKC信號(hào)通路，加

5、入Gen預(yù)孵育2h，再加入Aβ25-35繼續(xù)培養(yǎng)24h后，檢測(cè) PKC活性的改變；同時(shí)進(jìn)行形態(tài)觀察，MTT細(xì)胞活力檢測(cè)，Hoechst33342/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)，Caspase-3活性及細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度測(cè)定，研究PKC抑制劑Myr對(duì)Gen的細(xì)胞保護(hù)作用的影響，從而探討Gen調(diào)節(jié)PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用。通過Real time PCR檢測(cè)Gen及Myr對(duì)抗凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax表達(dá)的影響，從而進(jìn)一步探討染料木素對(duì)Aβ誘導(dǎo)

6、的PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Gen能有效提高Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞內(nèi)的PKC活性，這種磷酸化水平能被Myr所抑制；Myr抑制劑阻斷了染料木素對(duì)PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，使得細(xì)胞損傷程度增加，細(xì)胞活力降低，凋亡率、Caspase-3活性及細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度均升高。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，Gen能上調(diào)Bcl-2mRNA表達(dá)，下調(diào)Bax mRNA表達(dá)，增加Bcl-2/Bax的比值，從而抑制Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而Myr抑制劑可以阻斷Gen