紅豆杉多糖對AD小鼠模型學習記憶能力的影響及其機制研究.pdf

1、背景：
　　阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是多發(fā)生于老年期及老年前期的以進行性認知功能障礙和行為損害為特征,臨床上表現(xiàn)為記憶障礙、失語、失用、失認、視覺空間能力損害、抽象思維和計算能力損害、人格和行為的改變的中樞神經系統(tǒng)退行性病變。隨著我國國家國民經濟的上升，人民生活水平的提高，我國老年化進程逐年加劇，癡呆人口也隨著增加。據(jù)報道[1,2]：隨著人口老齡化的加劇，2010年我國阿爾茨海默病患者人數(shù)已成

2、為世界第一位，我國最終將成為名副其實的“AD大國”，擁有全世界最多的AD患者和最快的AD增長速度。如此迅猛增加的疾病負擔必將對我國的社會經濟發(fā)展和家庭生活產生重要的影響。AD的病因及發(fā)病機制目前尚未明確，目前研究主要集中于神經遞質失衡、神經細胞凋亡、自由基等學說[3]。由于AD的發(fā)病機理仍不十分明確，迄今尚未找到行之有效的治療藥物，目前美國FDA批準的藥物只有膽堿酯酶抑制劑和谷氨酸受體阻斷劑，這些藥物雖可以緩解癥狀，可以在一定程度上改善

3、AD患者的認知和行為能力，但其療效均十分有限，難以終止疾病的進展、逆轉疾病的進程。因此研究的重點在于AD的早期干預，所以努力探索和積極尋找能有效延緩病情發(fā)展及預防疾病發(fā)生的藥物，已成為當今世界醫(yī)學界亟待解決和攻克的重點課題。
　　近年來，隨著祖國醫(yī)學的不斷發(fā)展，目前已發(fā)現(xiàn)多種復方中藥及中藥單品被發(fā)現(xiàn)可用于AD的臨床治療，隨著技術的進展，中藥提取技術的不斷純熟。已發(fā)現(xiàn)許多中藥提取物可用AD的治療，目前主要有：銀杏葉及其提取物可用于治

4、療老年癡呆治療已獲得德國聯(lián)邦政府衛(wèi)生部門的批準[4-6]；枸杞多糖[7]用于治療老年癡呆的研究獲也已獲得國際上的認可；同時實驗研究發(fā)現(xiàn)肉蓯多糖[8]等均具有改善AD模型的學習記憶能力。多糖被列為目前研究的熱點項目。
　　課題組成員近年致力于紅豆杉多糖的研究10余年，已取得顯著成果，目前已完成多糖提取分離及純度測定技術（獲國家發(fā)明專利：ZL03129421.9），同時已完成紅豆杉多糖安全性實驗，并陸續(xù)發(fā)現(xiàn)該多糖具有抗腫瘤、抗氧化、調

5、節(jié)免疫、干預心肌缺血再灌注損傷（獲國家發(fā)明專利：200810120862.2）等多種生物學特性和功能[9-10]。近年在臨床實踐中觀察到紅豆杉多糖能改善AD患者的學習及記憶能力，根據(jù)課題組前期系列研究成果推測其可通過抗氧化、抑制細胞凋亡從而發(fā)揮改善AD小鼠模型學習及記憶能力。所以本研究以紅豆杉多糖作用于AD小鼠模型，以期證實其對AD小鼠模型的學習及記憶能力的影響作用，并進一步探討其作用機理。
　　第一章紅豆杉多糖對AD模型小鼠學習

6、及記憶能力的影響
　　目的：
　　探討紅豆杉多糖對AD模型小鼠學習記憶能力的影響。
　　方法：
　　雄性ICR小鼠120只隨機分成為空白組，模型組，陽性藥物組（鹽酸多奈哌齊），紅豆杉多糖低、中、高劑量組，每組20只?？瞻捉M頸部皮下注射生理鹽水，其余各組頸部皮下注射D-半乳糖1000mg/kg.d，共8周，制備AD小鼠模型。造模第4周起，空白組和模型組給予NS10ml/kg.d灌胃，陽性藥物組給予鹽酸多奈哌齊1mg

7、/kg.d灌胃，紅豆杉多糖低、中、高劑量組分別按200,400,800 mg/kg.d，連續(xù)4周灌胃紅豆杉多糖，末次給藥后，利用Morris水迷宮檢測小鼠學習及記憶能力。
　　結果：
　?。?）各組小鼠體重變化未見明顯差異；（2）定位航行實驗中，空白對照組、陽性藥物組、紅豆杉多糖各劑量組與模型組對比，小鼠學習潛伏期縮短(P＜0.05, P＜0.01)；（3）空間探索實驗中，空白對照組、多奈哌齊陽性藥物組、紅豆杉多糖低、中、高

8、劑量組小鼠經過平臺次數(shù)明顯多于模型組（P＜0.05,P＜0.01）。水迷宮實驗結果顯示，隨著訓練時間延長，各組小鼠總游程段潛伏期逐漸降低。說明紅豆杉多糖及鹽酸多奈哌齊均對AD模型學習記憶能力有一定的改善作用。其中以紅豆杉多糖低劑量組及鹽酸多奈哌齊陽性藥物組的迷宮結果與模型組比較，差異較為明顯。提示紅豆杉多糖可改善AD模型小鼠學習及記憶能力。
　　結論：
　　紅豆杉多糖具有改善AD模型學習及記憶能力的作用；根據(jù)課題組前期研究，

9、推測其可能通過抗氧化、抑制細胞凋亡等從而發(fā)揮其改善學習記憶能力的作用。
　　第二章紅豆杉多糖對AD模型小鼠腦組織氧化應激損傷的影響
　　目的：
　　探討紅豆杉多糖對AD模型小鼠海馬氧化應激的保護作用。
　　方法：
　　雄性ICR小鼠120只隨機分為空白組，模型組，陽性藥物組（鹽酸多奈哌齊），紅豆杉多糖低、中、高劑量組，每組20只?？瞻捉M頸部皮下注射等量生理鹽水，其余各組頸部皮下注射D-半乳糖1000mg/k

10、g.d注射，共8周，制備AD小鼠模型。造模第4周起，空白組和模型組給予NS10ml/kg.d灌胃，陽性藥物組給予鹽酸多奈哌齊1mg/kg.d灌胃，紅豆杉多糖低、中、高劑量組分別按200,400,800mg/kg.d，連續(xù)4周灌胃紅豆杉多糖，末次給藥后，隨機取12只小鼠腦組織勻漿，比色法檢測小鼠腦組織中SOD活性及MDA含量；酶聯(lián)免疫吸附法檢測腦組織總抗氧化能力；隨機取4只小鼠腦組織進行免疫組化檢測海馬區(qū)Nrf2的表達；
　　結果：

11、
　　D-半乳糖模型組與空白組比較，腦組織勻漿中SOD活性明顯降低、MDA含量均明顯升高（P＜0.05, P＜0.01）。紅豆杉多糖各劑量組、陽性藥物組與模型組比較，腦組織勻漿中SOD活性明顯提高、MDA含量明顯減低（P＜0.05,P＜0.01），以紅豆杉多糖中、低劑量組升高或者降低明顯（P＜0.01）；D-半乳糖模型組的T-AOC低于空白對照組（P＜0.05）；紅豆杉多糖高、中、低劑量組及多奈哌齊陽性藥物組T-AOC皆高于D-半

12、乳糖模型組（P＜0.05, P＜0.01）；D-半乳糖模型組與空白組比較海馬區(qū)Nrf-2的表達的IOD值比較明顯下降（P＜0.05），鹽酸多奈哌齊陽性藥物組及紅豆杉多糖低、中、高劑量組與D-半乳糖模型組比較，腦組織海馬區(qū)Nrf-2的表達的IOD值均升高（P＜0.05, P＜0.01），其中以紅豆杉多糖中劑量升高最為明顯（P＜0.01）。
　　結論：
　　紅豆杉多糖改善AD小鼠學習及記憶能力可能與其抗腦組織氧化應激損害相關。<

13、br>　　第三章紅豆杉多糖對AD模型小鼠海馬組織細胞凋亡及Aβ的影響
　　目的：
　　探討紅豆杉多糖對AD模型小鼠海馬細胞凋亡及海馬Aβ淀粉樣沉積的影響。
　　方法：
　　雄性ICR小鼠120只隨機分為空白組，模型組，陽性藥物組（鹽酸多奈哌齊），紅豆杉多糖低、中、高劑量組，每組20只。空白組頸部皮下注射生理鹽水，其余各組頸部皮下注射D-半乳糖1000mg/kg.d注射，共8周，制備AD小鼠模型。造模第4周起，空白

14、組和模型組給予NS10ml/kg.d灌胃，陽性藥物組給予鹽酸多奈哌齊1mg/kg.d灌胃，紅豆杉多糖低、中、高劑量組分別按200,400,800mg/kg.d，連續(xù)4周灌胃紅豆杉多糖；末次給藥后，隨機取3只小鼠麻醉后開胸暴露心臟，5％福爾馬林灌注，取腦，HE染色比較海馬細胞形態(tài)變化；隨機取4只小鼠進行免疫組化檢測海馬區(qū)Caspase-3的表達；隨機取12只小鼠腦組織勻漿，酶聯(lián)免疫吸附法檢測腦組織勻漿Aβ淀粉樣蛋白的含量；
　　結果

15、：
　　D-半乳糖模型組與空白組比較，腦組織勻漿中Aβ淀粉樣蛋白含量均明顯升高（P＜0.05）。紅豆杉多糖各劑量組與模型組比較，腦組織勻漿中Aβ淀粉樣蛋白含量，均明顯降低（P＜0.05,P＜0.01）；D-半乳糖模型組與空白對照組比較，海馬區(qū)Caspase-3的表達IOD值上升（P＜0.01），紅豆杉多糖低、中劑量組及鹽酸多奈哌齊陽性藥物組與D-半乳糖模型組比較，腦組織海馬區(qū)Caspase-3的表達IOD值下降（P＜0.05, P