母體期慢性鋁暴露對子代大鼠海馬LTP、PKC活性和Ng含量的影響.pdf

1、鋁大量蓄積體內可產生毒性作用。國內外許多流行病學調查和研究表明，鋁易致神經元損傷，引起智力和認知能力下降等學習和記憶方面的缺欠，且這是一個長期的慢性的神經病理過程，涉及到腦發(fā)育的各個階段。 海馬是學習記憶的關鍵腦區(qū)，海馬長時程增強(long-term potentiation，LTP)是NMDA (N-甲基-D-門冬氨酸)受體依賴性突觸傳遞效能的持續(xù)性增強，是公認的腦學習記憶功能在突觸水平的研究模型和神經基礎。因此，研究鋁暴露對

2、LTP及與其突觸機制有關的各項生化指標的影響，有助于從突觸和蛋白分子水平闡明鋁損害腦學習記憶功能的作用機制。目前雖然鋁對LTP損害作用的觀察很多，但鋁對LTP損害作用的突觸機制尚未完全闡明。已明確，蛋白激酶C(proteinkinase C，PKC)是LTP產生的必需酶，而神經顆粒素(Neurogranin，Ng)是一種突觸后腦特異性蛋白質，是PKC的天然作用底物，與LTP的誘導與維持關系密切。同時，母體期是子代腦發(fā)育的一個重要時期，母

3、體期鋁暴露會不會感染子代，是一個關系到子代健康的大問題。因此，本實驗擬采用母體慢性鋁暴露大鼠模型，觀察母體期鋁暴露對子代大鼠海馬LTP誘導和維持、PKC活性及Ng含量的影響，以期從PKC及Ng角度為闡明此發(fā)育階段鋁影響LTP的機制提供一個新視點。 材料與方法 一、實驗材料 1、實驗動物 wistar大鼠，♀：♂為3:1(體重150-200g)及其所繁殖的子代鼠。 2、主要試劑 三氯化鋁(分

4、析純)；抗大鼠Ng單克隆抗體；堿性磷酸酶標記的兔抗山羊二次抗體；PepTag非放射性PKC活性測定試劑盒。 3、主要儀器 大鼠跳臺反應箱；通用電泳儀；凝膠電泳成像系統(tǒng)；低溫冷凍離心機；Spectronic21型的紫外-可見分光光度計；電生理相關儀器；瓊脂糖凝膠電泳儀。 二、實驗方法 1、分組及動物模型建立雌性Wistar大鼠45只隨機分為3組，從其與雄性大鼠合籠始至子代斷乳止，在飼料相同條件下，分別飲用蒸

5、餾水、0.2％及0.4％氯化鋁(A1C13)溶液。 2、行為學測定采用跳臺法檢測鋁對學習記憶行為的影響，記錄大鼠第1次跳下平臺的時間(潛伏期)和5 min內受到電擊(即跳下)次數(shù)(錯誤次數(shù))。 3、電生理LTP測定20％烏拉坦(urethane，6.5ml/kg，ip)麻醉后，將動物頭部固定于腦立體定位儀上，在Schaffer側枝部位(坐標：前囟后3.3mm；旁開3.8mm；皮層下3.8mm)插入刺激電極。 4、

6、海馬PKC活性的測定采用瓊脂糖凝膠電泳方法測定海馬PKC的活性。參照PepTag非放射性PKC活性測定試劑盒說明書。 5、Ng含量的測定采用Western blot方法測定海馬Ng的含量。 6、腦組織及血液中鋁含量測定采用原子吸收石墨爐法測定腦鋁和血鋁含量。 7、統(tǒng)計學處理采用SPSS13.0(statistical package for the social science，SPSS)統(tǒng)計分析處理軟件對數(shù)據(jù)進

7、行處理，P<0.05視為有統(tǒng)計學意義。實驗所得數(shù)據(jù)資料用X±S表示。 實驗結果 一、記憶行為學指標與對照組大鼠第1次跳下平臺的潛伏期(300±0.00秒)相比，0.2％-Al(202.71±81.99秒)和0.4％-Al組(19.67±8.44秒)差異均非常顯著，P<0.01。兩暴露組5min內錯誤次數(shù)(1.43±0.85次，2.47±0.99次)與對照組(0.00±0.00次)相比也均存在顯著差異，P<0.05。兩暴露

8、組之間差異也具有統(tǒng)計學意義， P<0.01。 二、電生理LTP測試結果HS后，與對照組PS幅值增強率(143.94±29.93％)相比，0.2％-Al(115.29±14.80％)和0.4％(103.62±13.70％)，差異均非常顯著，P<0.01。但兩暴露組之間差異不顯著，P>0.05。 三、海馬PKC活性測定結果(PKC活性單位為pmol/min·mg)與對照組海馬組織PKC的全細胞(827.60±42.52)、胞

9、膜(340.99±24.50)、胞漿活性(481.32±22.52)及胞膜與胞漿PKC活性比值(0.7114±0.0686)相比，0.2％-Al組(506.41±20．56、155.69±12.63、55.79±25.98、0.4411±0.0623)和0.4％-Al組(494.65±6.81、140.11±4.44、353.44±8.28、0.3966±0.0163)均降低，差異顯著，P<0.01。但兩暴露組的各項指標差異不顯著，P>

10、0.05。 四、海馬Ng含量測定結果與對照組海馬Ng表達的灰度值(62.56±8.74)相比，0.2％-Al組(52.33±4.01)和0.4％-Al組(50.75+5.99)差異顯著，P<0.01。但兩暴露組之間差異不顯著，P>0.05。 五、腦組織與血中的鋁含量測定結果與對照組腦鋁含量(6.21±2.37μg/g)、血鋁含量(33.9μ38.74μg/L)相比，0.2％-Al組(15.68±4．48μg/g、47.4

11、3±14.38μg/L)和0.4％-Al組(18.79±5.18μg/g、55.56±19．07μg/L)差異均顯著，P<0.01。但兩暴露組之間差異不顯著，P>0.05。 討論 母體期是子代腦發(fā)育重要階段，此期的母體鋁暴露對子代腦的智力發(fā)育是否有影響，是一個值得關注的方面。因此，研究鋁及其化合物在母體期的潛在發(fā)育毒性，對鋁導致的兒童智力和認知能力低下性神經疾病的早期治療與預防具有重要意義。由實驗結果可見，母體慢性鋁暴露

12、可損害子代海馬LTP的誘導與維持，其損害的程度有隨暴露劑量增加而加重的趨勢，行為學測試的結果也從側面反映了這種關系。腦鋁與血鋁的變化趨勢也基本與之一致。 本實驗結果顯示，母體鋁暴露的子代大鼠的海馬PKC全細胞活性、胞膜、胞漿活性及胞膜與胞漿活性比值，與對照組相比，都分別呈顯著性降低，我們分析認為，鋁通過抑制PKC活性而使LTP產生的必需物質-B-50及NMDA受體的磷酸化調節(jié)發(fā)生障礙，從而損害大鼠LTP及導致其學習記憶能力下降。

13、 本實驗對子代大鼠進行海馬Ng的含量測定結果顯示，與對照組相比，母體鋁暴露的子代大鼠海馬Ng含量下降，有統(tǒng)計學意義。推測Ng含量下降的原因之一可能是樹突棘數(shù)量的減少和細胞缺失，因為有研究表明，鋁負荷過量大鼠海馬CA<,1>區(qū)神經元核固縮和神經元減少現(xiàn)象明顯。 總之，對母體實施鋁暴露會影響到子代，且鋁對在LTP機制中起重要作用的PKC和Ng的影響是多方面的，需要進一步的探討。 結論： 1、母體期慢性鋁暴露可