急性鉛暴露對(duì)幼年大鼠腦海馬中PKC-γ，NOS，NO的影響.pdf

1、目的： 重金屬鉛是一種普遍存在的環(huán)境神經(jīng)毒物，具有很強(qiáng)的神經(jīng)親和性，可在神經(jīng)組織中蓄積，引起神經(jīng)系統(tǒng)功能(主要是學(xué)習(xí)記憶功能)的長(zhǎng)期損害。特別是對(duì)兒童學(xué)習(xí)，記憶，心理行為的影響受到人們的普遍關(guān)注。由于兒童血腦屏障發(fā)育不完整，當(dāng)血鉛水平達(dá)到100 μg/L時(shí)便能導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶及行為異常。因此探討鉛致神經(jīng)中毒機(jī)制非常重要。 目前鉛神經(jīng)毒作用機(jī)制研究中的一個(gè)重要內(nèi)容就是探討鉛對(duì)中樞神經(jīng)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中的兩個(gè)重要因素鈣和蛋白激酶

2、功能的影響。后者如蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)，細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellularsignal-reglJlated protein Kinase，ERK)、一氧化氮合酶(nitric oxidesynthase，NOS)等。 蛋白激酶C是一種鈣活化的磷脂依賴(lài)性的絲氨酸/蘇氨酸激酶。在調(diào)控細(xì)胞的許多生理過(guò)程，特別是在細(xì)胞內(nèi)信息傳遞途徑中，PKC起著一個(gè)關(guān)鍵的作用。目前，在鉛的神經(jīng)毒性研究過(guò)程

3、中，鉛對(duì)PKC的作用引起人們極大關(guān)注。鉛比鈣對(duì)PKC有更高的親和力?，F(xiàn)己知，Pb<'2+>可以取代Ca<'2+>激活蛋白激酶在學(xué)習(xí)記憶中的正常功能和PKC γ同工酶的分布。從而干擾LTP(長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng))的形成和維持。但做為腦組織中所獨(dú)有的蛋白激酶C的一個(gè)亞型，PKC-γ在小鼠腦組織中的表達(dá)變化情況尚未清楚，有進(jìn)一步進(jìn)行研究的可行性。本研究通過(guò)對(duì)急性染鉛小鼠腦海馬中PKC—Y的異常表達(dá)探討鉛的神經(jīng)毒理作用機(jī)制。 一氧化氮(nitri

4、c oxide，NO)作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞間的信息分子，在腦海馬內(nèi)主要影響學(xué)習(xí)記憶功能。一氧化氮合酶(NOS synthase，NOS)是催化合成內(nèi)源性NO的唯一酶類(lèi)，在很大程度上決定著NO的生物學(xué)效應(yīng)。NOS是鉛毒作用的靶分子之一，本研究通過(guò)NOS活性和NO含量測(cè)定，進(jìn)一步探討急性染鉛對(duì)它們的影響機(jī)制。本研究從細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)角度較全面地探討鉛對(duì)學(xué)習(xí)記憶影響的生化機(jī)制。證明急性鉛中毒可干擾PKC-γ的表達(dá)，擾亂NOS活性和降低NO含量，使

5、小鼠空間學(xué)習(xí)記憶及被動(dòng)回避反應(yīng)學(xué)習(xí)記憶能力下降。為揭示鉛中毒機(jī)制提出了新觀(guān)點(diǎn)。 方法: 1．大鼠急性鉛暴露腦片的制作出生30d健康大鼠，頸部脫臼法處死，迅速取出海馬，放入預(yù)冷的人工腦脊液(ACSF，mmol·L<'-1>NaCl 124，KCl 4．4，CaCl<,2> 2．5，MgSO<,4> 1．3，NaH<,2>PO<,4>l，NaHCO<,3>26，葡萄糖10)中。將海馬橫切為350 μm腦片放到6孔培養(yǎng)板中，分

6、為對(duì)照組和染鉛組。用預(yù)先通以95％O<,2>+5％CO<,2>的混合氣體的ACSF灌流，流速1 mL·min<'-1>，溫度32.5～33.5℃。穩(wěn)定2 h后，染鉛組改用含20 μmol·L<'-1>醋酸鉛的ACSF灌流。醋酸鉛加入培養(yǎng)板時(shí)間計(jì)時(shí)為0 min．。分別于0，3，7．5，15，30，60，120 min．收集腦片，即為急性染鉛大鼠海馬腦片樣品，對(duì)照組始終以ACSF灌流并與急性染鉛組同一時(shí)間收集腦片。將培養(yǎng)的大鼠海馬腦片放到0

7、.5 g·L<'-1>MTT中室溫觀(guān)察15 min．，如顏色由白變黑則證明存活。在所有腦片收集完成后剩余的腦片仍然存活則保留所收集的樣品，否則棄之。在10倍于其體積的裂解緩沖液中迅速攪成勻漿。將樣品以12000g離心1hr。吸出上清液，棄去沉淀，加入樣品緩沖液，將制備好的樣品置于-70℃冰箱備用。 2．測(cè)定指標(biāo)及方法2．1利用PKC-γ抗體，Western blot方法測(cè)定急性染鉛小鼠海馬中PKC-γ異常表達(dá)(標(biāo)本處理，提取蛋白

8、質(zhì)，蛋白定量，電泳，電轉(zhuǎn)移，封閉，一抗孵育，二抗孵育，顯色)。 2．2利用NO和NOS試劑盒測(cè)定NO含量和NOS活性(原理是采用檢測(cè)NO的中間代謝產(chǎn)物亞硝酸鹽來(lái)反映NO。離心后取上清液再加入檢測(cè)試劑，酶標(biāo)儀測(cè)吸光度值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程計(jì)算亞硝酸鹽的含量，換算出NO含量。采用放射強(qiáng)度測(cè)定法測(cè)定NOS活性)。 3．統(tǒng)計(jì)分析處理 數(shù)據(jù)以x±s表示，用SPSS 11.5軟件統(tǒng)計(jì)包進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。 結(jié)果:

9、 1．急性鉛暴露對(duì)小鼠海馬組織中PKC-γ蛋白表達(dá)的影響正常組小鼠海馬在培養(yǎng)液培養(yǎng)前后PKC-γ表達(dá)基本保持不變，同濃度醋酸鉛暴露的小鼠經(jīng)過(guò)相應(yīng)不同時(shí)間的染鉛海馬中PKC-γ表達(dá)與正常組相比有不同程度的變化。染鉛組小鼠海馬中PKC-γ表達(dá)在30和60min時(shí)分別有所下降，120 min后恢復(fù)到接近正常水平。 2．急性鉛暴露對(duì)小鼠海馬中一氧化氮合酶活性的影響正常組小鼠海馬在培養(yǎng)液培養(yǎng)前后一氧化氮合酶活性基本保持不變，同濃度醋

10、酸鉛暴露的小鼠經(jīng)過(guò)相應(yīng)不同時(shí)間的染鉛海馬中一氧化氮合酶活性與正常組相比有不同程度的變化。染鉛組小鼠海馬中一氧化氮合酶活性在30和60min時(shí)分別有所下降，120 min后恢復(fù)到接近正常水平。 3．急性鉛暴露對(duì)小鼠海馬中一氧化氮的影響正常組小鼠海馬在培養(yǎng)液培養(yǎng)前后一氧化氮含量基本保持不變，同濃度醋酸鉛暴露的小鼠經(jīng)過(guò)相應(yīng)不同時(shí)間的染鉛海馬中一氧化氮含量與正常組相比有不同程度的變化。染鉛組小鼠海馬中一氧化氮含量在30和60min時(shí)分別

11、有所下降，120min后恢復(fù)到接近正常水平。 結(jié)論: 1．與正常組相比不同時(shí)間的鉛暴露可引起PKC-γ的異常表達(dá)；在30和60min時(shí)分別有所下降，120 min后恢復(fù)到接近正常水平。 2．與正常組相比不同時(shí)間的鉛暴露可對(duì)一氧化氮合酶活性，一氧化氮含量有明顯的影響；在30和60min時(shí)分別有所下降，120 min后恢復(fù)到接近正常水平。 3．第一部分與第二部分得到的結(jié)果反映出，鉛對(duì)小鼠腦細(xì)胞中的PKC-γ的