2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、目的:
  金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是一種可寄生于宿主體表的條件致病菌,同時也是引起局部化膿性感染,肺炎,心內(nèi)膜炎及全身膿毒血癥等醫(yī)院獲得性感染的主要致病菌。由于抗生素的濫用,出現(xiàn)耐受多種抗生素的新菌株,特別是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的迅速蔓延,使得單純依靠抗生素治療該病原菌引起的相關(guān)感染變得越來越困難。金黃色葡萄球菌疫苗的研究再次成為全球的熱點。
  最近幾年,發(fā)展基于多價保護(hù)性的亞單位融

2、合疫苗是新型疫苗設(shè)計與研發(fā)的優(yōu)選研究策略。其最主要的目標(biāo)是利用多價抗原靶向多個毒力因子,而這些毒力因子對病原菌的致病作用十分關(guān)鍵,因而多價抗原的策略更易研發(fā)出針對金黃色葡萄球菌的有效疫苗。
  在宿主對抗金黃色葡萄球菌感染的過程中,體液免疫與細(xì)胞免疫都發(fā)揮著重要的作用。理想的抗金黃色葡萄球菌疫苗應(yīng)該包含一些分泌性毒素抗原和細(xì)胞壁偶聯(lián)的相關(guān)抗原,而這些抗原能夠激發(fā)宿主產(chǎn)生保護(hù)性抗體以及誘導(dǎo)產(chǎn)生分泌IFN-γ和(或)IL-17的T細(xì)胞

3、,而IL-17對于中性粒細(xì)胞驅(qū)動與活化十分重要。
  本研究的目的是構(gòu)建基于IsdB與Hla為基礎(chǔ)的雙價融合疫苗,同時比較該雙價疫苗與單價的重組候選抗原在小鼠全身系統(tǒng)性MRSA感染動物模型中的免疫保護(hù)作用差異。進(jìn)一步探究該基因工程雙價亞單位融合疫苗所產(chǎn)生的保護(hù)性抗體(調(diào)理抗體,中和抗體)及獲得性免疫細(xì)胞應(yīng)答(IFN-γ,IL-17A)在免疫保護(hù)中的作用機(jī)制,為新型有效的基因工程多價亞單位融合疫苗的分子設(shè)計,抗原選擇及配伍優(yōu)化奠定堅

4、實的實驗基礎(chǔ)與理論指導(dǎo)。
  方法:
  1.從MRSA252中提取細(xì)菌基因組作為PCR的模板,通過重疊延伸PCR擴(kuò)增目的基因HI,同時引入酶切位點BamHI與NotI。目的基因雙酶切后的回收產(chǎn)物與pGEX-6P-2表達(dá)載體相連,轉(zhuǎn)化到EscherichiacoliBL21菌株,在IPTG的誘導(dǎo)下表達(dá)GST融合蛋白,帶GST標(biāo)簽的融合蛋白經(jīng)PSP酶切初純,然后經(jīng)CaptoTMMMC層析,過QHP去內(nèi)毒素精細(xì)純化,最終的產(chǎn)物經(jīng)

5、SDS-PAGE電泳進(jìn)行分析。
  2.通過尾靜脈注射MRSA252細(xì)菌,建立BALB/c小鼠全身感染的膿毒癥動物模型。BALB/c小鼠用重組蛋白加鋁佐劑免疫,并用PBS加鋁佐劑作為對照組。小鼠在末次免疫后,用MRSA252致死劑量1×109CFU感染小鼠,在感染后的14天里監(jiān)測小鼠的生存狀況。同時,用2.5×108CFU感染劑量感染小鼠,并對感染后臟器的細(xì)菌定植量與病理損傷進(jìn)行檢測與分析。
  3.為了評價重組蛋白疫苗主動

6、免疫后的體液免疫應(yīng)答,用ELISA的方法檢測了針對不同重組蛋白抗原的特異性抗體,同時進(jìn)行了抗體介導(dǎo)的調(diào)理吞噬作用實驗。為了評價重組蛋白疫苗的細(xì)胞免疫應(yīng)答,檢測了免疫后脾細(xì)胞在重組蛋白體外刺激后的分泌的細(xì)胞因子水平(IFN-γ,IL-5,IL-17A),并進(jìn)行了分泌細(xì)胞因子介導(dǎo)的殺傷作用實驗。為了評價免疫小鼠感染后腎臟細(xì)胞因子的水平,檢測了IFN-γ,IL-17A和CXCL2的水平。
  結(jié)果:
  1.構(gòu)建表達(dá)載體質(zhì)粒pGE

7、X-6P-2-HI,經(jīng)IPTG誘導(dǎo),重組蛋白以可溶形式進(jìn)行表達(dá)并且其純化是高效的,SDS-PAGE分析其蛋白分子量與預(yù)期的一致。
  2.建立了穩(wěn)定的BALB/c小鼠全身感染的膿毒癥動物模型。重組亞單位融合疫苗HI免疫后,用致死劑量攻毒,與對照組相比,其顯著提高了生存保護(hù)率(P=0.0002),與IH,IsdB,Hla,和鋁佐劑組,分別提高了6.7%,20%,26.7%和66.7%的保護(hù)率;用感染劑量攻毒,與對照組相比,重組蛋白(

8、HI,IH,IsdB,Hla)免疫后均能在一定程度上減少細(xì)菌在血液,脾臟,腎臟中的定植,同時減輕了病理的炎性損傷,而在所有組中,HI組的細(xì)菌定植量是最低的,同時腎臟的病理損傷也是最輕的。
  3.重組亞單位融合疫苗HI免疫后產(chǎn)生了強(qiáng)的抗體應(yīng)答,其中最高抗體效價為1:512000。產(chǎn)生的抗體針對其對應(yīng)的亞單位IsdB與HlaH35L也有強(qiáng)的抗原抗體反應(yīng)。重組抗原HI免疫小鼠后,體外刺激產(chǎn)生了脾細(xì)胞產(chǎn)生了較高IFN-γ,IL-5和IL

9、-17A細(xì)胞因子水平。HI誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)能夠增強(qiáng)體外抗體介導(dǎo)的調(diào)理吞噬作用與細(xì)胞因子介導(dǎo)的殺傷作用。HI免疫小鼠,在感染后腎臟中IFN-γ,IL-17A和CXCL2水平高于對照組,也高于IsdB和Hla組。
  結(jié)論:
  1.一種基于IsdB與Hla的亞單位融合疫苗HI成功的構(gòu)建,表達(dá)。用該融合的雙價疫苗免疫后誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生了強(qiáng)的抗體與T細(xì)胞免疫應(yīng)答。
  2.該雙價亞單位融合疫苗產(chǎn)生的免疫保護(hù)強(qiáng)于其對應(yīng)的亞單位產(chǎn)生的

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