小麥抗條銹病基因Yr41的精細(xì)定位和兩個(gè)條銹菌誘導(dǎo)表達(dá)基因的功能研究.pdf

1、小麥條銹病是由條銹菌(Puccinia striiformis West.f.sp.tritici)引起的葉部真菌病害，是世界性的小麥病害，在中國尤為嚴(yán)重，嚴(yán)重危害小麥產(chǎn)量與品質(zhì)。培育抗病小麥品種是防治條銹病的有效方法，但隨著條銹菌新生理小種的不斷出現(xiàn)，特別是V26新小種的出現(xiàn)，致使大部分抗病小麥品種喪失抗性。通過對(duì)抗病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記開發(fā)和精細(xì)定位，為抗病基因的克隆、分子標(biāo)記輔助育種和多基因聚合的持久抗性品種培育奠定基礎(chǔ)，對(duì)小麥

2、抗條銹病遺傳育種研究具有理論和實(shí)踐價(jià)值。小麥抗病防御反應(yīng)是多基因參與的調(diào)控過程，通過對(duì)抗條銹病調(diào)控基因的克隆與表達(dá)特性分析，探討這些基因在抗條銹病防御反應(yīng)中的作用機(jī)理，為闡明寄主與條銹菌間互作的分子機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)。
　　本研究以抗條銹病基因Yr41載帶的小麥抗病品種川農(nóng)19(CN19)為研究材料，通過構(gòu)建的CN19/MY11遺傳連鎖作圖群體及其高代重組自交系，進(jìn)行了條銹菌CRY32接種下的作圖群體單株抗病性鑒定和遺傳分析;采用比

3、較基因組分析和BSA-RNA-Seq測(cè)序方法，進(jìn)行了EST-STS和SNP引物的開發(fā)和標(biāo)記篩選，繪制Yr41基因的精細(xì)連鎖遺傳圖;利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Q-RT-PCR)與病毒誘;基因沉默(VIGS)的技術(shù)，對(duì)已克隆的條銹菌誘導(dǎo)表達(dá)基因TaLHY和TaNIT，進(jìn)行了基因表達(dá)特性與功能研究，主要研究結(jié)果如下:
　　1.配制了小麥品種CN19/MY11雜交F1、F2、F2∶3代研究群體，進(jìn)行了抗條銹病遺傳分析，進(jìn)一步明確了小麥品種C

4、N19中含有的Yr41基因是一個(gè)顯性的成株期抗條銹病基因;構(gòu)建了含3212個(gè)單株的CN19/MY11雜交F2代遺傳作圖群體及其高代重組自交系，通過小麥2BS上公布的EST序列，設(shè)計(jì)了127個(gè)EST-STS分子標(biāo)記引物，利用F2∶3分離群體分組法(BSA)對(duì)該EST-STS引物進(jìn)行篩選，共獲得了8對(duì)與Yr41基因基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，通過Kosambi函數(shù)計(jì)算與目的基因的連鎖關(guān)系:BE444541-BE474133-BE604911-Y

5、r41-BE446068-BE444659-BF478477-BI479116-BE496167，分子標(biāo)記間相對(duì)遺傳距離分別為0.83、0.19、0.06、0.19、0.06、0.44、0.19與0.32cM，使Yr41基因兩邊連鎖標(biāo)記距離由8.9cM縮短至0.25cM，最小標(biāo)記達(dá)到0.06cM，將Yr41基因進(jìn)一步定位在小麥2BS3-0.84-1.00區(qū)段內(nèi)。
　　2.通過Blast本地化程序?qū)⒕o密連鎖的8條EST序列與小麥基因

6、組草圖以及短柄草、水稻和玉米基因組進(jìn)行同源關(guān)系分析，根據(jù)同源基因位點(diǎn)，共設(shè)計(jì)201個(gè)分子標(biāo)記，但篩選結(jié)果顯示這些分子標(biāo)記與Yr41沒有連鎖關(guān)系。通過生物信息學(xué)方法對(duì)這8條EST序列對(duì)應(yīng)的基因注釋結(jié)果顯示，近共分離的EST序列BE604911注釋信息為THO復(fù)合體，該蛋白在擬南芥中證實(shí)為植物抗病防御的關(guān)鍵蛋白，可作為Yr41的候選基因進(jìn)一步研究。
　　3.通過對(duì)重組自交系(RIL)F6代中抗病和感病兩個(gè)表現(xiàn)型50(純抗)+50（純感

7、）樣本組進(jìn)行BSA-RNA-Seq轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序，共得到57.14Gb Clean Data。利用生物信息方法對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，共計(jì)注釋約1.5萬個(gè)小麥新基因，在抗病和感病兩個(gè)表現(xiàn)型樣本組中篩選到5919個(gè)差異表達(dá)基因。對(duì)BSA群體進(jìn)行SNP位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)定位分析，在2BS染色體上尋找到52個(gè)SNP位點(diǎn)，其中有38個(gè)SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)出四引物擴(kuò)增受阻突變體系引物。通過對(duì)作圖群體單株DNA的PCR產(chǎn)物檢測(cè)，共計(jì)發(fā)現(xiàn)4個(gè)SNP位點(diǎn)與Yr41緊密

8、連鎖，他們與目的基因的連鎖關(guān)系為3523042/2963-3523042/3033-5186704/3797-Yr41-5245446/8902，其中3523042/2963、3523042/3033與5186704/3797分子標(biāo)記與目的基因的遺傳距離為0.06 cM，5245446/8902分子標(biāo)記的遺傳距離為0.25cM，增加了Yr41所在區(qū)段的密度。
　　4.對(duì)TaLHY基因的表達(dá)和功能研究結(jié)果初步證明了該基因調(diào)控和參與小

9、麥的穗生長與抗條銹病的防御反應(yīng)過程;發(fā)現(xiàn)TaLHY是小麥晝夜節(jié)律基因，具有白天上調(diào)表達(dá)，夜晚下調(diào)表達(dá)量特性。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果顯示，TaLHY基因主要在小麥葉、穗與莖組織中表達(dá)，根部表達(dá)較少;外源激素SA能極顯著的誘導(dǎo)該基因上調(diào)表達(dá)。在拔節(jié)期對(duì)抗病小麥CN19進(jìn)行VIGS基因沉默，發(fā)現(xiàn)TaLHY沉默植株無法抽穗，對(duì)條銹菌生理小種條中32親和互作表現(xiàn)感病(IT=4)。
　　5.利用VIGS方法對(duì)克隆的TaNIT(晴水解酶)