六個小麥條銹病菌誘導的UniGene表達特性分析及TaLHY和TaNIT基因的克隆.pdf

1、條銹病(Puccinia striiformis f.sp. tritic)是我國小麥的主要病害，特別是在我國西部地區(qū)由于適宜的發(fā)病條件，使條銹病近年來成為該小麥生態(tài)區(qū)最嚴重的病害。條銹菌生理小種變異快，條銹病抗源匱乏，可利用的抗性基因較少和條銹病原菌與寄主植物互作及植物抗病機理復雜，分子機理尚不清楚是限制了抗條銹病新品種的培育的原因。因此，在不斷地發(fā)現(xiàn)新的抗性基因，快速培育具有持久抗性的突破性小麥新品種的同時，加強條銹病原菌與寄主識別

2、及植物抗病的分子機理研究，克隆抗條銹病及其相關基因，是推動從根本上解決小麥條銹病威脅的關鍵。
　　 本研究在已經(jīng)構(gòu)建的小麥條銹菌條中32(CY32)誘導的抗條銹病品種川農(nóng)19(CN19)的抑制差減雜交(SSH-cDNA)文庫、并獲得了大量差異表達ESTs的基礎上，從中挑選出6個抗病相關的UniGene進行了表達特性分析，利用RACE技術(shù)和電子克隆技術(shù)對其中的2個基因進行全長克隆研究，以期從轉(zhuǎn)錄水平探討條銹菌誘導的抗病反應分子機理

3、和發(fā)掘抗條銹病相關基因。研究結(jié)果如下：
　　 1應用半定量RT-PCR技術(shù)對SSH-cDNA文庫中篩選的6個抗病相關的UniGene在不同組織、病原菌誘導、激素處理和非生物脅迫條件下進行表達特性分析。6個UniGene已經(jīng)在文庫篩選過程中功能注釋分別為VTC2,SAMDC，SHMT,半乳糖結(jié)合凝集素，JIP和LHY蛋白。①組織特異性表達分析結(jié)果表明，6個UniGene均能在拔節(jié)期的根、莖、葉及穗，和苗期的根和葉中表達，其中在穗或

4、根中表達水平相對較高；②病原菌誘導表達結(jié)果表明，6個UniGene對條銹菌和白粉菌誘導的應答反應模式不同。CN19在接種CY32后，6個UniGene皆能在24-48小時內(nèi)被誘導表達，積累到比較高的水平，而白粉病菌浸染后僅有半乳糖結(jié)合凝集素、VTC2和JIP基因在接種48小時后開始表達，在96小時達到高峰。推測SAMDC、SHMT及LHY基因是小麥條銹菌(CY32)誘導的高豐度表達基因；③激素誘導表達分析表明，6個UniGene皆對應答

5、乙烯(Et)產(chǎn)生應答反應，而對SA和ABA產(chǎn)生不同的應答反應，推測CN19與CY32不親和互作反應主要通過Et/JA途徑調(diào)控，SA與ABA對防御反應中的部分基因具有調(diào)控作用；④JIP、植物凝集素基因和SHMT也參與冷、干旱和高鹽非生物脅迫的應答反應。
　　 2 TaLHY基因的克隆與生物信息學分析：從構(gòu)建的SSH-cDNA文庫中，利用RACE-PCR技術(shù)克隆了一個小麥MYB轉(zhuǎn)錄因子--TaLHY基因。其cDNA全長3085bp，

6、其開放閱讀框為1947bp，推測編碼蛋白為648個氨基酸，分子量為70.3kDa,等電點為6.34;具有一個典型的植物MYB-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，在結(jié)構(gòu)域的C-端具有十分保守的氨基酸序列SH[AL]QKY[RF]，與其他已公布的LHY家族成員具有較高的序列一致性，首次在小麥中報道了LHY蛋白，亞細胞定位分析TaLHY蛋白定位于細胞核，參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄、信號轉(zhuǎn)導功能。TaLHY基因能在條銹菌誘導48小時后表達水平提高，同時在Et處理

7、1小時和4小時表達水平提高，證明了該基因參與小麥抗條銹病防御反應相關，同時，該基因參與防御反應可能是通過JA/Et途徑調(diào)控。
　　 3目的基因TaNIT克隆與生物信息學分析：利用電子克隆結(jié)合RT-PCR技術(shù)，克隆了一個小麥腈水解酶基因一一TaNIT基因。其cDNA全長1457bp，開放閱讀框為1023bp，編碼340個氨基酸，分子量約為36.3kDa，理論等電點pI為5.70;具有典型的NIT家族結(jié)構(gòu)域，和保守的Glu-Lys-