利用CDK抑制劑-SU9516體外生產(chǎn)豬孤雌激活四倍體囊胚.pdf

1、現(xiàn)如今，四倍體廣泛的應(yīng)用在動(dòng)物繁殖技術(shù)領(lǐng)域中，特別是在干細(xì)胞中利用四倍體和二倍體制備嵌合體來研究動(dòng)物胚外組織缺陷。通過不同的技術(shù)有多種四倍體囊胚的制作方法，但是不同制備方法都存在不同程度的優(yōu)缺點(diǎn)，需要不斷開發(fā)新的四倍體制備方法。因此，本研究使用一種新型細(xì)胞周期性依賴激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)抑制劑SU9516體外高效誘導(dǎo)豬孤雌激活(parthenogenetic activation，PA)四倍體囊胚

2、。SU9516可以通過抑制豬PA胚胎第二極體的排出以及抑制中心體復(fù)制兩方面來體外制備豬PA四倍體囊胚。同時(shí)，SU9516可以通過抑制CDK1活性間接降低MPF活性來提高豬PA胚胎體外發(fā)育能力。本研究主要包括以下幾個(gè)實(shí)驗(yàn):
　　一、SU9516體外制備豬PA四倍體囊胚。
　　試驗(yàn)1:電激活豬胚胎之后，在豬PA胚胎體外培養(yǎng)液中添加不同濃度SU9516促進(jìn)豬其體外發(fā)育能力。結(jié)果表明:添加10μMSU9516與其他濃度（1μM，5μ

3、M，100μM）及素對(duì)照組5μg/ml細(xì)胞松弛(cytochalasin B，CB)相比可以顯著地提高豬PA胚胎體外發(fā)育能力(47.5％ vs.26.2％，28.9％，40.6％，and25.8％，P＜0.05)。用最佳濃度(10μM)SU9516處理不同的時(shí)間后觀察胚胎體外發(fā)育能力，結(jié)果表明:SU9516處理4h豬PA胚胎具有最好的體外發(fā)育能力(47.5％vs.39.0％，33.7％，and39.1％)。
　　試驗(yàn)2:電激活豬P

4、A胚胎之后，分別利用添加10μM SU9516或5μg/ml CB的體外培養(yǎng)液中處理2h后觀察豬PA胚胎第二極體的排出情況。結(jié)果表明:10μMSU9516組，5μg/ml CB組與未處理組相比顯著地降低了第二極體的排出率(14.0％，13.8％ vs.78.8％P＜0.05)。為了確定囊胚的染色體組數(shù)，對(duì)SU9516組合、CB組處理后獲得的豬PA囊胚進(jìn)行核型分析。結(jié)果顯示:SU9516處理組的囊胚中四倍體率顯著地高于CB處理組(55.8

5、％ vs.14.0 P＜0.05)
　　試驗(yàn)3:為了進(jìn)一步確認(rèn)不同處理組中豬PA囊胚的染色體組數(shù)。利用Hoechest33342染色不同處理組中的細(xì)胞數(shù)目。結(jié)果表明:SU9516處理組中囊胚細(xì)胞數(shù)顯著地低于CB組以及6-DMAP組(34.4±17.58 vs.46.4±10.5a，45.1±10.6a)。
　　二、SU9516抑制MPF活性提高豬PA胚胎體外發(fā)育能力。
　　實(shí)驗(yàn)1:分別檢測10μM SU9516和5μg

6、/ml CB處理豬PA胚胎4h后MPF表達(dá)活性。結(jié)果顯示:SU9516處理下的豬PA胚胎MPF活性水平顯著地低于CB組(103.2pg/ml vs.131 pg/ml)。
　　總結(jié):1、1）SU9516處理提高豬PA胚胎體外發(fā)育能力最佳條件為10μM，4h。
　　2)SU9516可以抑制豬PA胚胎第二極體排出和誘導(dǎo)豬PA四倍體囊胚。
　　3)SU9516處理可以顯著地降低豬PA囊胚細(xì)胞數(shù)。
　　2、SU9516通