豬胚胎體外生產(chǎn)和孤雌囊胚發(fā)育能力的檢測.pdf

1、掌握和建立較為成熟的豬胚胎體外生產(chǎn)技術，完善其操作程序、提高豬胚胎生產(chǎn)效率，可以為利用豬體外胚胎進行胚胎干細胞分離培養(yǎng)奠定基礎。目前，豬卵母細胞體外成熟、體外受精和孤雌激活等均取得很大進展，但有些方面尚待優(yōu)化；體外生產(chǎn)獲得的胚胎的發(fā)育能力，特別是能否利用體外生產(chǎn)的胚胎來分離豬胚胎干細胞還未能取得突破性進展。本研究以屠宰場取得的豬卵巢和養(yǎng)殖場取得的豬新鮮精液為原材料，對豬體外受精、孤雌激活以及孤雌囊胚在飼養(yǎng)層上的發(fā)育能力進行部分研究，旨在

2、完善豬胚胎實驗室生產(chǎn)體系和探討孤雌囊胚的后期發(fā)育能力，為豬胚胎體外生產(chǎn)和胚胎干細胞分離等相關研究提供參考和依據(jù)。實驗驗結(jié)果如下：
　　 （1）統(tǒng)計總結(jié)了本地區(qū)不同月份從屠宰場取得的卵巢，每個卵巢可以獲得的有效卵母細胞數(shù)；探討了卵母細胞成熟培養(yǎng)基中促性腺激素PMSG和hCG的不同添加時間對卵母細胞成熟的影響。結(jié)果表明，8、9、10和4月份為卵巢采集用于實驗的最佳時間；在培養(yǎng)方面，添加促性腺激素組和后22小時不添加促性腺激素組卵母細

3、胞成熟率為80.35±0.76％和82.75±0.85％，差異不顯著（P>0.05）。
　　 （2）探討了豬新鮮精液17℃恒溫保存時間和精子活力的關系，并用于體外受精后對受精效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，精液保存24h以內(nèi)活力保持在0.9，保存3d的精液活力可以保持在0.7以上，3d后精液活力下降至0.5以下；保存1d以內(nèi)的豬精液相比于保存4-5d的精液用于體外受精后，受精卵在卵裂率、桑葚胚率以及囊胚率方面差異顯著（P<0.05），保存

4、3d以內(nèi)的豬精液用于體外受精，結(jié)果顯示受精卵在卵裂率、桑葚胚率以及囊胚率方面差異不顯著（P>0.05），保存4-5d的精液用于體外受精后，受精卵在卵裂率、桑葚胚率以及囊胚率方面差異不顯著（P>0.05）。
　　 （3）探討了精卵共孵育時間和視磺酸RA對受精卵發(fā)育效果的影響。結(jié)果表明，精卵共同孵育6h和7h后，受精卵卵裂率為55.90±9.77％和54.51±13.25％，共孵育5 h和8h卵裂率為52.31±4.84％和53.8

5、5±7.16％，差異不顯著（P>0.05）；但在囊胚率方面，6h組囊胚率為11.89±3.64％，顯著差異于5h和8h組5.55±0.63％和3.85±2.12％（P<0.05）；在成熟液中添加0nM、5nM、25nM和50nM RA后成熟的卵母細胞用于體外受精，結(jié)果表明，受精卵在卵裂率、桑葚胚率和囊胚率方面無統(tǒng)計學差異，0nM和5nM組囊胚率要高于25nM組和50nM組。
　　 （4）探討了不同電擊參數(shù)對體外成熟的卵母細胞孤雌

6、激活后發(fā)育的影響。結(jié)果表明，激活參數(shù)為1.5 Kv/cm，1個DC，100μs時，能有效地激活體外成熟卵母細胞發(fā)育至囊胚，顯著差異于1.5Kv/cm/1DC/60μs和1.5Kv/cm/1DC/80μs組；激活參數(shù)為2.0Kv/cm，1個DC，60μs時，囊胚率為18.70±0.93％，顯著差異于2.0Kv/cm，1個DC，100μs組（P<0.05）；而脈沖次數(shù)為1個或2個時，對孤雌效果無顯著影響。
　　 （5）探討了孤雌囊胚

7、的體外發(fā)育能力。結(jié)果表明，在含飼養(yǎng)層細胞的培養(yǎng)基中添加小分子物質(zhì)CHIR99021和PD0325901培養(yǎng)孤雌囊胚，與對照組相比囊胚貼壁率差異不顯著（P>0.05）；用牛胎兒成纖維細胞CEF作為飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng)孤雌囊胚，囊胚貼壁率為33.67±9.84％，顯著差異于MEF組19.08±0.52％和PEF組23.47±5.69％（P<0.05），MEF和PEF在支持囊胚細胞貼壁方面差異不顯著（P>0.05）；用NCSU-23作為培養(yǎng)基培養(yǎng)孤

8、雌囊胚，囊胚貼壁率為22.53±2.46％，顯著高于DMEM組的10.41±1.75％和DMEM/NCSU-23組的12.05±2.23％（P<0.05）。
　　 綜上所述，本地區(qū)8、9、10和4月份為卵巢采集用于實驗的最佳時間；豬新鮮精液17℃恒溫保存3d內(nèi)精子活力保持在0.7以上，都能很好的用于體外受精；精卵共孵育6h對受精卵發(fā)育最好；電擊參數(shù)1.5Kv/cm、100μs、1DC或2DC和2.0Kv/cm、60μs、1DC或