部分艾滋病患者HIV-1毒株耐藥的實(shí)驗(yàn)和臨床研究.pdf

1、目的:通過對(duì)3例長(zhǎng)期接受多種抗病毒方案治療的艾滋病患者進(jìn)行系統(tǒng)的基因型和表型耐藥性分析，并對(duì)其毒株進(jìn)行生物學(xué)表型鑒定，了解病人基因型和表型耐藥性的特征、相互關(guān)系以及對(duì)抗病毒治療的影響，為認(rèn)識(shí)臨床耐藥性發(fā)生特點(diǎn)、提高抗病毒治療效果提供依據(jù)。 材料與方法: (1)病例來源：在北京佑安醫(yī)院選取6例(A、B、C、D、E、F)既往使用多種治療方案、臨床懷疑多重耐藥的艾滋病患者，男女各3例，性傳播1例，血液傳播5例，平均治療時(shí)間3年

2、，平均使用過3個(gè)治療方案，目前的抗病毒治療失敗。對(duì)每位病人進(jìn)行問卷調(diào)查，并抽取EDTA．抗凝靜脈血20ml。 (2)HIV-1毒株分離培養(yǎng)：使用正常人外周血淋巴細(xì)胞(PBMCs)與艾滋病患者的PBMCs共培養(yǎng)的方法分離HIV-1毒株。 (3)基因型耐藥性鑒定：提取純化血漿和病毒培養(yǎng)上清液的HIV-1 RNA，以RI-PCR方法擴(kuò)增部分pol區(qū)(約1.3kb)，直接進(jìn)行序列測(cè)定，將測(cè)得的序列在斯坦福大學(xué)的數(shù)據(jù)庫(http:

3、//hivdb.stanfrod.edu/hiv/)進(jìn)行比對(duì)，確定耐藥突變位點(diǎn)，進(jìn)行耐藥性解釋。 (4)表型耐藥性鑒定：將分離的HIV-1毒株在含有系列稀釋的抗病毒藥物的PBMCs培養(yǎng)系統(tǒng)中進(jìn)行培養(yǎng)，檢測(cè)培養(yǎng)上清液的．P24抗原，計(jì)算藥物的IC50，與野生株11B比較，確定IC50的倍數(shù)變化。參照病人服藥的歷史選擇藥物，共進(jìn)行了4株病毒、6種藥物，共24次表型耐藥性檢測(cè)。 (5)毒株生物學(xué)表型鑒定：以培養(yǎng)上清液提取的HI

4、V-1 RNA為模版，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用nest-PCR擴(kuò)增HIV-1 env區(qū)基因(約1.5kp)，測(cè)序，與標(biāo)準(zhǔn)株序列比較，確定毒株的基因亞型；根據(jù)V3環(huán)氨基酸電荷數(shù)預(yù)測(cè)病毒的細(xì)胞嗜性；在MT-4細(xì)胞上測(cè)定分離株的融合誘導(dǎo)性。 結(jié)果: (1)6名艾滋病患者中有3人(A、B、C)成功分離出HIV-1毒株(a、b、c)，在PBMCs上成功傳代，感染性滴度(TCID<,50>/ml)分別是6.3×10<'3>、10.2×1

5、0<'3>、2.51×10<'3>。 (2)基因型耐藥性檢測(cè)： 病例A血漿中檢出11個(gè)耐藥性突變位點(diǎn)，分別是M41L、M184V、L210W、T215F、A98G、K103R、V179E、Y181C、G190A、L63P、V77I，提示對(duì)3TC、FTC、DLV、EFV、NVP高度耐藥，對(duì)ABC、AZT、d4T、ddI中度耐藥，對(duì)TDF低度耐藥。上清病毒與之相比，無M184V突變。 病例B血漿中檢出5個(gè)耐藥性突變位

6、點(diǎn)，分別是M184V、V179DV、L63P、V77I、193L，提示對(duì)3TC、FTC高度耐藥，對(duì)ABC、DLV、EFV、NVP低度或潛在耐藥，對(duì)AZT、d4T、ddI、TDF敏感。上清病毒無V179DV突變，但存在K103N。 病例C血漿中檢出11個(gè)耐藥性突變位點(diǎn)，分別是K65R、T69I、K70R、K219R、K101I、K103E、V106M、Y181C、L63P、193L、L10X，提示對(duì)DLV、EFV、NVP高度耐藥，

7、對(duì)3TC、d4T、ddI、FTC、TDF中度耐藥，對(duì)ABC、AZT低度或潛在耐藥。上清病毒無K101I、K103E和K70R突變。 3位患者均對(duì)蛋白酶抑制劑(PIs)敏感。 (3)表型耐藥性檢測(cè)： AZT、d4T、ddI、3TC、IDV、NVP對(duì)毒株a的IC<,50>分別是0.0250umol/L、0.1019 umol/L、0.2446 umol/L、0.8176 umol/L、0.0357 umol/L、0.

8、2926umol/L，分別是野毒株11B的25倍、4.31倍、9.2倍、163.5倍、0.5倍和146.3倍；對(duì)毒株b的IC<,50>分別是0.0051 umol/L、0.0454 umol/L、0.0379 umol/L、0.359 umol/L、0.024 umol/L、3.3992 umol/L，分別是野毒株11B的5.1倍、1.92倍、1.43倍、71.8倍、0.33倍和1700倍；對(duì)毒株c的IC<,50>分別是0.0055 u

9、mol/L、0.001 umol/L、0.0469 umol/L、0.5056 umol/L、0.174 umol/L、9.4993 umol/L，分別是野毒株11B的5.5倍、0.04倍、1.77倍、101.1倍、2.4倍和4750倍。 (4)3株分離株以env區(qū)為基礎(chǔ)，病例B/C與泰國B亞型接近，病例A與美國B亞型接近；細(xì)胞嗜性預(yù)測(cè)均為M-嗜性；在M1T-4細(xì)胞上均未出現(xiàn)致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)；復(fù)制動(dòng)力學(xué)為慢/高型。 結(jié)論

10、: (1)上述3例使用過多個(gè)方案的艾滋病患者已產(chǎn)生對(duì)使用藥物的多重耐藥突變，主要導(dǎo)致對(duì)NRTIs和NNRTIs的耐藥；蛋白酶基因區(qū)主要是次要突變，對(duì)PIs敏感。 (2)表型耐藥結(jié)果顯示，在多個(gè)方案治療失敗的AIDS患者中，3TC和NVP對(duì)臨床分離株IC<,50>的倍數(shù)升高達(dá)數(shù)百至數(shù)千倍，提示在治療許可的情況下需要更有效的藥物來替換此兩種藥物。 (3)依從性較差和治療策略的不完善是目前AIDS患者出現(xiàn)耐藥、治療失敗