單細(xì)胞內(nèi)活性氧化學(xué)熒光法的測(cè)定.pdf

1、目的：1.利用離子影像系統(tǒng)(IonImagingsystem)，建立測(cè)定單細(xì)胞內(nèi)活性氧含量的方法；2.建立模擬心肌缺血/再灌注以及氧化應(yīng)激模型，給予抗氧化劑還原型谷胱甘肽(GSH)，用雙波長(zhǎng)比例測(cè)量法測(cè)定單個(gè)心室肌細(xì)胞內(nèi)活性氧含量的變化，以驗(yàn)證此方法的可行性。 方法：1.采用酶法急性分離成年大鼠心室肌細(xì)胞。以含鈣1.8mM的臺(tái)氏液制備細(xì)胞懸液，加入10μM的熒光染料二氯二氫熒光素—乙酰乙酸酯(2',7'-Dichlorofluo

2、rescindiacetate，DCFH-DA)，(同時(shí)加0.2％BSA以防止DCFH-DA由細(xì)胞內(nèi)外漏)，35℃恒溫負(fù)載15分鐘后，以臺(tái)氏液清洗三次，洗去細(xì)胞外多余的染料，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。2.用含雙氧水(10mM)的臺(tái)氏液灌流細(xì)胞，造成氧化應(yīng)激。設(shè)定激發(fā)光波長(zhǎng)從340nm到580nm，以20nm波長(zhǎng)的間隔遞增，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行熒光激發(fā)，用離子影像系統(tǒng)測(cè)定熒光信號(hào)，選擇熒光強(qiáng)度值最大和最小的兩個(gè)激發(fā)光波長(zhǎng)。3.模擬心肌缺血/再灌注模型：用含乳酸(2

3、0mM)，pH值為6.6的缺血臺(tái)氏液灌流細(xì)胞模擬缺血，20分鐘后換用正常臺(tái)式液(pH值為7.4)灌流。氧化應(yīng)激模型：用含雙氧水(10mM)的臺(tái)氏液灌流細(xì)胞。用離子影像系統(tǒng)測(cè)定上述各模型心室肌細(xì)胞不同時(shí)期以及應(yīng)用抗氧化劑還原型谷胱甘肽(GSH)后活性氧含量的變化。 結(jié)果：1.用離子影像系統(tǒng)測(cè)定負(fù)載化學(xué)熒光指示劑DCFH-DA心室肌細(xì)胞的熒光信號(hào)，熒光強(qiáng)度值最大和最小的兩個(gè)激發(fā)光波長(zhǎng)分別是：480nm和420nm，所以選擇這兩個(gè)波長(zhǎng)

4、作為用雙波長(zhǎng)比例測(cè)量法測(cè)定心室肌細(xì)胞內(nèi)活性氧含量的兩個(gè)激發(fā)光波長(zhǎng)，以F480/F420的比值表示活性氧的含量。2.模擬心肌缺血再灌注模型，用雙波長(zhǎng)比例測(cè)量法測(cè)定的結(jié)果為：心室肌細(xì)胞在模擬缺血期和恢復(fù)再灌注期的F480/F420分別為缺血前的115.27±4.52％和116.99±3.99％，二者間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。若在再灌注期給予含有抗氧化劑GSH(0.8mM)的臺(tái)式液，則活性氧含量降為缺血前的101.14±3.20％，明顯低于單純臺(tái)氏液

5、再灌注組(p＜0.05)。3.建立氧化應(yīng)激模型，用雙波長(zhǎng)比例測(cè)量法測(cè)定的結(jié)果為：心室肌細(xì)胞在氧化應(yīng)激期活性氧含量(F480/F420)為刺激前的132.56±4.33％，換用臺(tái)氏液繼續(xù)灌流，活性氧含量(F480/F420)仍然保持較高水平，為刺激前的132.91±4.32％，二者間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。若在雙氧水刺激后用含有抗氧化劑GSH(0.8mM)的臺(tái)氏液灌流細(xì)胞，活性氧含量則下降至刺激前的100.12±5.91％，明顯低于氧化應(yīng)激期(p

6、＜0.05)。 結(jié)論：1.應(yīng)用離子影像系統(tǒng)，以DCFH-DA作為化學(xué)熒光指示劑，可以探測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧含量的變化。2.480nm和420nm是用雙波長(zhǎng)比例測(cè)量法測(cè)定單細(xì)胞內(nèi)活性氧含量的兩個(gè)最適激發(fā)波長(zhǎng)，可以F480/F420的比值表示活性氧的含量。3.建立模擬心肌缺血/再灌注及氧化應(yīng)激模型，在再灌注期及氧化應(yīng)激后加入抗氧化劑還原型谷胱甘肽，用雙波長(zhǎng)比例測(cè)量法可以檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)活性氧的變化，證明此方法可以用于測(cè)定心室肌細(xì)胞內(nèi)活性氧的含