用于檢測細胞內活性氧自由基的熒光探針的設計、合成及生物應用.pdf

1、在生物體新陳代謝過程中產(chǎn)生多種自由基，它們對維持生物體正常生理功能發(fā)揮重要作用，同時自由基含量的變化與機體衰老和疾病發(fā)生又有著緊密聯(lián)系，當其含量激增時可破壞體內代謝平衡，導致生理功能紊亂。臭氧(O3)是活性氧自由基(ROS)的一種，平流層中的臭氧阻止了大量的太陽紫外線，對流層中的臭氧則在危害著生物圈的安全。臭氧作為對體內炎癥和外界刺激的響應還可以內源性產(chǎn)生，通過誘導細胞質膜的改變、破壞離子通道、改變酶的活性等誘導細胞功能紊亂，導致多種疾

2、病如皮膚癌、呼吸道疾病等。目前用于檢測O3的方法較少，包括化學發(fā)光法(CL)、電化學方法(EL)、熒光法等，由于檢測靈敏度低、選擇性差和反應時間長等使得對臭氧的研究遠遠不如其他活性氧。臭氧在細胞內的生理功能、參與的信號轉導途徑、與疾病的關系等仍不明確，因此發(fā)展適合生物體系臭氧檢測的方法具有重要研究意義。
　　熒光探針與活細胞內自由基作用時可發(fā)生熒光強度或吸收波長位置變化，借助于激光共聚焦成像技術，可以實現(xiàn)細胞內活性小分子的“可視化

3、”檢測，從而對它們在生物體內的動態(tài)變化進行實時監(jiān)控。
　　以近紅外熒光團花菁(Cy)為母體，以L-色氨酸(L-Trp)為識別基團，設計合成了一種近紅外O3檢測熒光探針(Trp-Cy)。
　　在化學體系中對探針與O3的反應條件進行優(yōu)化。Trp-Cy對H2O2(120μM)、NaClO(24μM)、·OH、t-BuOOH(30μM)、GSH和VC(300μM)的響應很低，對O3的檢測無干擾；Trp-Cy能與O3迅速反應，熒光強度

4、明顯增強并達到最大值且保持相對穩(wěn)定；探針熒光強度隨著加入O3濃度的增加明顯增強。O3濃度為1.0×10-6~7.0×10-6 M，表明Trp-Cy能檢測臭氧濃度的微弱變化。
　　通過MTT試驗研究探針對細胞體系的影響，當細胞50％存活時探針濃度為465μM，表明 Trp-Cy對細胞是低毒性的。采用激光共聚焦顯微成像技術，實現(xiàn)了肺癌細胞 A549內O3的實時檢測。
　　綜上所述，探針Trp-Cy具有以下特點:⑴激發(fā)和發(fā)射位于近

5、紅外區(qū)(分別為630 nm、770 nm)，有效地避免了細胞內自身熒光的干擾，減少了對細胞的損傷；⑵具有較大的斯托克斯位移(達140 nm)，有效地避免了探針的自猝滅，提高了檢測靈敏度及準確性；⑶能與O3迅速反應，不受共存的其他活性分子或金屬離子的干擾，有利于實時檢測細胞內O3的微小變化；⑷探針自身熒光較弱，與O3結合后熒光顯著增強；⑸能特異性靶向線粒體。
　　該探針靈敏度高、反應迅速、毒性低的特點在O3對生物體系影響的研究中具有