P47phox介導氧暴露后單個核細胞內(nèi)活性氧簇產(chǎn)生的機制.pdf

1、目的:觀察32周以下早產(chǎn)兒不同濃度氧暴露后，外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMCs)內(nèi)p47phox與活性氧簇產(chǎn)生的變化;以及運用NADPH氧化酶抑制劑二苯基碘(DPI)和夾竹桃麻素(apocynin)聯(lián)合高濃度氧處理PBMCs后，p47phox與活性氧簇水平的改變，來探討NADPH氧化酶亞單位p47phox調(diào)節(jié)PBMCs內(nèi)活性氧簇升高的機制，為臨床中減輕早產(chǎn)兒氧化應激損傷尋找新

2、的靶點。
　　方法:實驗分兩部分進行。第一，以臨床中32周以下早產(chǎn)兒為對象，將其中入院時診斷為新生兒呼吸窘迫綜合征(Neonatal respiratory distresssyndrom，NRDS)且需要吸氧的患兒作為氧暴露組，根據(jù)吸氧濃度不同分為三組:FiO2＜30％為低濃度吸氧組、FiO2在(30-40)％為中濃度吸氧組、FiO2＞40％為高濃度吸氧組，每組患兒各10例，其中男18例，女12例。胎齡(28-32)周，體重(1

3、350±138)g，組間患兒胎齡、出生體重無顯著性差異。同期選擇10例32周以下暫未吸氧的早產(chǎn)兒作為空氣組，其中男5例，女5例。胎齡(30-32)周，體重(1347±116)g。氧暴露組與空氣組間患兒胎齡、出生體重無顯著性差異，具有可比性。該實驗通過四川醫(yī)科大學附屬醫(yī)院倫理委員會的批準，所有患兒進行實驗前均征得家屬同意并簽署知情同意書。空氣組及氧暴露組患兒不同濃度氧療48小時后，均經(jīng)橈動脈采血3ml。分離取得PBMCs及血清標本用于檢測

4、。實驗第二部分，出生后即入我科的32周以下早產(chǎn)兒，尚未吸氧前，征得家屬同意并簽署知情同意書后經(jīng)橈動脈采血2 ml，經(jīng)Ficoll密度梯度離心法，分離純化PBMCs，以PBMCs為對象，將其分為以下四組:常規(guī)培養(yǎng)組，置于37℃、50 ml/L的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h;高氧處理組，按3 L/min通入950ml/L的O2與50 ml/L的CO2混合氣體，10 min后，立即用封口膠密封培養(yǎng)瓶，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h;高氧聯(lián)合DPI處理

5、組與高氧聯(lián)合夾竹桃麻素(apocynin)處理組根據(jù)文獻報道和預實驗結果，分別選擇5μmol/L、100μmol/L處理細胞后再按上述方法建立高氧損傷模型并培養(yǎng)48 h;高氧及相應處理組培養(yǎng)48 h后，均用CYS-1數(shù)字式測氧儀檢測培養(yǎng)瓶中O2的濃度，將低于900 ml/L O2的標本棄去。離心采集PBMCs和培養(yǎng)液作為標本。將兩部分實驗中所獲得的標本，均采用Mitosox Red標記結合激光共聚焦顯微鏡檢測PBMCs內(nèi)ROS的生成量、

6、硫代巴比妥酸比色法檢測血清/培養(yǎng)液中丙二醛含量、免疫熒光檢測p47phox在細胞內(nèi)的定位及移位率、Western blot檢測p47phox的蛋白表達量。
　　結果:第一，臨床樣本中，隨著早產(chǎn)兒吸氧濃度的升高，PBMCs內(nèi)活性氧與血清丙二醛明顯升高，p47phox由包質(zhì)向包膜移位的細胞數(shù)增多，p47phox的移位率明顯增加，p47phox的蛋白表達量也隨之增加（P均＜0.05）;第二，培養(yǎng)PBMCs各組中，PBMCs經(jīng)高氧及相應藥

7、物處理48h后，與高氧處理組相比，其余三組活性氧和丙二醛明顯減少，p47phox移位率與表達量也顯著降低(P均＜0.05）;與常規(guī)培養(yǎng)組相比，高氧聯(lián)合DPI處理組及高氧聯(lián)合apocynin處理組中ROS、丙二醛、p47phox移位率與表達量并無顯著差異(P均＞0.05）。
　　結論:早產(chǎn)兒和PBMCs經(jīng)氧暴露后，p47phox可增加向胞膜移位，上調(diào)其表達量，這與ROS和丙二醛增加是一致的。而對PBMCs運用NADPH氧化酶抑制劑D