微重力生物反應器內球形體培養(yǎng)對脂肪源性干細胞干性的影響.pdf

1、背景:間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的干性特征(stemnessproperties)包括自我更新能力和多向分化潛能，是其應用于組織工程和再生醫(yī)學的重要基礎。脂肪源性干細胞(adipose tissue-derived stem cells，ADSCs)是一種組織來源豐富的MSCs，可從臨床脂肪抽吸術獲得的大量皮下脂肪組織中提取。無論是骨髓還是脂肪組織，MSCs占組織細胞中比例極小，必須經(jīng)過大量擴

2、增培養(yǎng)才能夠獲得治療應用需要的足夠數(shù)量細胞。但在傳統(tǒng)的單層細胞培養(yǎng)過程中，MSCs隨著擴增傳代次數(shù)的增加或培養(yǎng)時間延長，逐漸失去干性特征。因此，探索維持MSCs干性的體外培養(yǎng)方法是MSCs進一步臨床應用研究急需解決的關鍵問題之一。
　　MSCs在體內能夠長久地維持自我更新與多向分化潛能的干性特征。越來越多的研究表明，細胞微環(huán)境在決定細胞的干性特征中發(fā)揮重要作用。三維細胞培養(yǎng)較傳統(tǒng)細胞培養(yǎng)方法提供的細胞微環(huán)境更相似于體內微環(huán)境。多種

3、三維細胞培養(yǎng)模式，如多孔支架材料或高分子材料聚合物支架材料、凝膠、細胞聚集體等已被應用于多種干細胞的干性維持。其中球形培養(yǎng)技術是利用細胞自我聚集形成細胞球的特性而建立的一種無支架材料的三維細胞培養(yǎng)方法。以往研究發(fā)現(xiàn)采用懸滴法和低粘附材料法進行球形體培養(yǎng)能有效維持MSCs的干性特征，但不適合大規(guī)模培養(yǎng)。微重力生物反應器是可用于細胞大規(guī)模培養(yǎng)和球形體制備的有效方法，但迄今為止尚未見微重力生物反應器培養(yǎng)MSCs形成球形體對MSCs干性影響的相

4、關研究報道。因此，本研究應用微重力生物反應器對ADSCs進行球形體培養(yǎng)，明確微重力生物反應器內球形體培養(yǎng)對ADSCs干性的影響。
　　方法:
　　1.本研究采用無酶分離法和膠原酶消化法從脂肪抽吸術的人脂肪組織中分離培養(yǎng)ADSCs，并應用細胞貼壁培養(yǎng)、流式細胞分析、免疫熒光和誘導分化等方法分別從細胞形態(tài)、免疫表型、胚層來源和多向分化潛能等方面鑒定分離的細胞。
　　2.運用微重力生物反應器對ADSCs進行球形體培養(yǎng)，對照分

5、析球形體培養(yǎng)與單層培養(yǎng)ADSCs在增殖能力、多能性基因表達、克隆形成率、多向分化潛能等干性指標上的差異，明確微重力生物反應器內細胞球形體培養(yǎng)對ADSCs干性的影響。
　　3、統(tǒng)計學分析:數(shù)據(jù)收集采用Excel2007，統(tǒng)計分析使用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件處理，計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間進行方差分析。
　　結果:
　　1.采用自行改良和建立的無酶分離法可從脂肪抽吸術的人脂肪組織中成功獲得具備自我更新和多向分化潛能

6、特性的ADSCs;
　　2.ADSCs在微重力生物反應器內培養(yǎng)可自發(fā)聚集形成直徑小于200μm的細胞球形體，并球形體內絕大部分細胞保持活性;
　　3.與單層培養(yǎng)相比較，微重力生物反應器內球形體培養(yǎng)可顯著上調ADSCs多能性基因如Oct4，Nanog，Sox-2和Rex-1的mRNA和蛋白表達;
　　4.微重力生物反應器內球形體培養(yǎng)來源ADSCs的細胞增殖能力和克隆形成率明顯高于持續(xù)單層培養(yǎng)的ADSCs;
　　5.

7、在合適的誘導培養(yǎng)條件下，球形體培養(yǎng)來源ADSCs不僅向中胚層成脂肪細胞、成骨細胞、成軟骨細胞分化效率更高，其轉分化為中胚層肝細胞和外胚層神經(jīng)元細胞的效率也明顯高于持續(xù)單層培養(yǎng)的ADSCs;
　　6.微重力生物反應器內球形體培養(yǎng)可上調ADSCs的E-Cadherin表達。
　　結論:
　　1.改良和建立了一種無酶分離ADSCs的方法，高效簡便，分離的細胞易于擴增培養(yǎng)，有望為多種疾病的細胞治療提供豐富的干細胞來源。