微重力生物反應(yīng)器內(nèi)球形體培養(yǎng)對脂肪源性干細(xì)胞干性的影響.pdf

1、背景:間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的干性特征(stemnessproperties)包括自我更新能力和多向分化潛能，是其應(yīng)用于組織工程和再生醫(yī)學(xué)的重要基礎(chǔ)。脂肪源性干細(xì)胞(adipose tissue-derived stem cells，ADSCs)是一種組織來源豐富的MSCs，可從臨床脂肪抽吸術(shù)獲得的大量皮下脂肪組織中提取。無論是骨髓還是脂肪組織，MSCs占組織細(xì)胞中比例極小，必須經(jīng)過大量擴

2、增培養(yǎng)才能夠獲得治療應(yīng)用需要的足夠數(shù)量細(xì)胞。但在傳統(tǒng)的單層細(xì)胞培養(yǎng)過程中，MSCs隨著擴增傳代次數(shù)的增加或培養(yǎng)時間延長，逐漸失去干性特征。因此，探索維持MSCs干性的體外培養(yǎng)方法是MSCs進一步臨床應(yīng)用研究急需解決的關(guān)鍵問題之一。
　　MSCs在體內(nèi)能夠長久地維持自我更新與多向分化潛能的干性特征。越來越多的研究表明，細(xì)胞微環(huán)境在決定細(xì)胞的干性特征中發(fā)揮重要作用。三維細(xì)胞培養(yǎng)較傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)方法提供的細(xì)胞微環(huán)境更相似于體內(nèi)微環(huán)境。多種

3、三維細(xì)胞培養(yǎng)模式，如多孔支架材料或高分子材料聚合物支架材料、凝膠、細(xì)胞聚集體等已被應(yīng)用于多種干細(xì)胞的干性維持。其中球形培養(yǎng)技術(shù)是利用細(xì)胞自我聚集形成細(xì)胞球的特性而建立的一種無支架材料的三維細(xì)胞培養(yǎng)方法。以往研究發(fā)現(xiàn)采用懸滴法和低粘附材料法進行球形體培養(yǎng)能有效維持MSCs的干性特征，但不適合大規(guī)模培養(yǎng)。微重力生物反應(yīng)器是可用于細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)和球形體制備的有效方法，但迄今為止尚未見微重力生物反應(yīng)器培養(yǎng)MSCs形成球形體對MSCs干性影響的相

4、關(guān)研究報道。因此，本研究應(yīng)用微重力生物反應(yīng)器對ADSCs進行球形體培養(yǎng)，明確微重力生物反應(yīng)器內(nèi)球形體培養(yǎng)對ADSCs干性的影響。
　　方法:
　　1.本研究采用無酶分離法和膠原酶消化法從脂肪抽吸術(shù)的人脂肪組織中分離培養(yǎng)ADSCs，并應(yīng)用細(xì)胞貼壁培養(yǎng)、流式細(xì)胞分析、免疫熒光和誘導(dǎo)分化等方法分別從細(xì)胞形態(tài)、免疫表型、胚層來源和多向分化潛能等方面鑒定分離的細(xì)胞。
　　2.運用微重力生物反應(yīng)器對ADSCs進行球形體培養(yǎng)，對照分

5、析球形體培養(yǎng)與單層培養(yǎng)ADSCs在增殖能力、多能性基因表達、克隆形成率、多向分化潛能等干性指標(biāo)上的差異，明確微重力生物反應(yīng)器內(nèi)細(xì)胞球形體培養(yǎng)對ADSCs干性的影響。
　　3、統(tǒng)計學(xué)分析:數(shù)據(jù)收集采用Excel2007，統(tǒng)計分析使用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間進行方差分析。
　　結(jié)果:
　　1.采用自行改良和建立的無酶分離法可從脂肪抽吸術(shù)的人脂肪組織中成功獲得具備自我更新和多向分化潛能

6、特性的ADSCs;
　　2.ADSCs在微重力生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)可自發(fā)聚集形成直徑小于200μm的細(xì)胞球形體，并球形體內(nèi)絕大部分細(xì)胞保持活性;
　　3.與單層培養(yǎng)相比較，微重力生物反應(yīng)器內(nèi)球形體培養(yǎng)可顯著上調(diào)ADSCs多能性基因如Oct4，Nanog，Sox-2和Rex-1的mRNA和蛋白表達;
　　4.微重力生物反應(yīng)器內(nèi)球形體培養(yǎng)來源ADSCs的細(xì)胞增殖能力和克隆形成率明顯高于持續(xù)單層培養(yǎng)的ADSCs;
　　5.

7、在合適的誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，球形體培養(yǎng)來源ADSCs不僅向中胚層成脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞分化效率更高，其轉(zhuǎn)分化為中胚層肝細(xì)胞和外胚層神經(jīng)元細(xì)胞的效率也明顯高于持續(xù)單層培養(yǎng)的ADSCs;
　　6.微重力生物反應(yīng)器內(nèi)球形體培養(yǎng)可上調(diào)ADSCs的E-Cadherin表達。
　　結(jié)論:
　　1.改良和建立了一種無酶分離ADSCs的方法，高效簡便，分離的細(xì)胞易于擴增培養(yǎng)，有望為多種疾病的細(xì)胞治療提供豐富的干細(xì)胞來源。