生物反應(yīng)器內(nèi)成骨細胞的擴增和組織工程骨的構(gòu)建.pdf

1、大連理工大學(xué)博士學(xué)位論文生物反應(yīng)器內(nèi)成骨細胞的擴增和組織工程骨的構(gòu)建姓名：宋克東申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：化學(xué)工程指導(dǎo)教師：劉天慶崔占峰20060501生物反應(yīng)器內(nèi)成骨細胞的擴增和組織工程骨的構(gòu)建性能檢測，并對培養(yǎng)過程中的營養(yǎng)代謝情況進行分析。結(jié)果顯示，在RWHMB內(nèi)動態(tài)培養(yǎng)的成骨細胞生長良好，分泌大量的細胞外基質(zhì)；中空纖維膜亦表現(xiàn)出良好的生物相容性。實驗結(jié)果證實RWHMB能結(jié)合RWVB和中空纖維膜的優(yōu)點，較好的模擬體內(nèi)環(huán)境，對所培養(yǎng)的細

2、胞施加適當(dāng)?shù)牧黧w應(yīng)力刺激，促進細胞的新陳代謝和物質(zhì)交換，更有利于細胞的生長及增殖。利用擴增出的成骨細胞作為種子細胞，將其分別以2lO％ells／ml和1106cells／ml兩種密度接種到生物衍生骨支架材料上，在RWVB內(nèi)進行三維組織工程骨的構(gòu)建。對所構(gòu)建的骨組織分別進行倒置顯微鏡(InvertedMicroscope)、掃描電鏡(SEM)、堿性磷酸酶(舢LPl、礦化結(jié)構(gòu)和AO／EB雙重?zé)晒馊旧壬飳W(xué)性能檢測，并對培養(yǎng)過程的營養(yǎng)物質(zhì)代

3、謝情況進行監(jiān)控和分析。結(jié)果顯示以這兩種密度接種在RWVB中培養(yǎng)的骨組織生長良好，能分泌大量膠原纖維，并有礦化基質(zhì)和新骨樣組織形成。通過RWVB內(nèi)部流體對流所產(chǎn)生的應(yīng)力刺激，可提高成骨細胞堿性磷酸酶的活性表達，并加速礦化結(jié)節(jié)的形成，從而完成成骨細胞的快速增殖與分化以及工程化組織的三維構(gòu)建。為進一步探索骨組織工程產(chǎn)業(yè)化的方法，用經(jīng)綠色熒光蛋白(Greenfluorescentprotein，GFP)標記的新西蘭兔顱骨來源的成骨細胞復(fù)合到生物

4、衍生骨支架材料上，在RWVB內(nèi)三維構(gòu)建組織工程骨，同時與靜態(tài)培養(yǎng)環(huán)境中構(gòu)建的組織工程骨進行比較。每12小時取樣一次，分別進行乳酸、葡萄糖、pH的測定，一周后取出標本通過掃描電鏡、激光共聚焦顯微鏡、組織學(xué)、免疫組織化學(xué)、流式細胞儀、細胞計數(shù)、染色體倍體分析等手段比較利用RWVB構(gòu)建的組織工程骨與靜態(tài)培養(yǎng)構(gòu)建的組織工程骨的差異。結(jié)果顯示RWVB中以兩種密度接種和構(gòu)建的組織生長良好，細胞仍保持正常的細胞周期和染色體形態(tài)，并且RWVB中的構(gòu)建物

5、的細胞擴增是靜態(tài)培養(yǎng)的5倍。研究結(jié)果進一步證實了骨組織工程產(chǎn)業(yè)化的現(xiàn)實可行性。對三維構(gòu)建的組織工程骨修復(fù)新西蘭兔橈骨大段骨缺損進行了動物實驗研究。制作新西蘭兔橈骨中段15mm骨缺損實驗?zāi)Ｐ?，隨機分為實驗組、對照組和空白組，實驗組植入經(jīng)RWVB構(gòu)建的組織工程骨、對照組植入靜態(tài)培養(yǎng)環(huán)境中構(gòu)建的組織工程骨、空白組僅植入空白的生物衍生骨支架材料。術(shù)后對動物進行大體觀察、x攝線觀察各組不同時期骨缺損的修復(fù)情況，并于術(shù)后4周和8周取出骨缺損區(qū)分別進

6、行大體觀察、組織學(xué)切片觀察和圖像分析新生骨的面積值。結(jié)果顯示術(shù)后8周實驗組的骨缺損幾乎完全修復(fù)，在三組中效果最好。空白組術(shù)后8周缺損區(qū)僅僅充滿纖維和結(jié)締組織。在RWVB構(gòu)建的生物衍生骨支架與成骨細胞的復(fù)合物具有很好的修復(fù)大段骨缺損的能力?？傊?，本研究確定了在RWVB和RWHMB中擴增骨組織工程種子細胞的最佳工藝和操作參數(shù)，明確了這兩種反應(yīng)器都可以提供低剪切力的培養(yǎng)環(huán)境，而且細胞之間有三維聯(lián)系的機會，成骨細胞表現(xiàn)出良好的體外擴增能力，適于