模擬微重力生物反應(yīng)器制備組織工程骨的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景及研究目的： 各種原因所致的骨缺損在臨床上十分常見，其治療的關(guān)鍵在于獲取足量成骨活性好的骨修復(fù)材料。組織工程技術(shù)能夠在體外制備生物活性良好的骨修復(fù)材料，但組織工程骨廣泛應(yīng)用于臨床尚需解決一系列技術(shù)和工藝問題，包括：種子細(xì)胞體外規(guī)?；瘮U(kuò)增方法、擴(kuò)增后生物安全性評估、種子細(xì)胞與支架材料高效均勻接種、大體積組織工程骨中心供養(yǎng)、如何降低組織工程骨中異種血清殘留量、組織工程骨的最佳體外培養(yǎng)時(shí)間和方式等。 生物反應(yīng)器的合理應(yīng)

2、用有望解決上述產(chǎn)業(yè)化問題，其中旋轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器(Rotating Wall Vessel Bioreactor，RWVB)具有剪切力小、傳質(zhì)作用好等優(yōu)點(diǎn)，繞水平軸旋轉(zhuǎn)的RWVB在一定條件下還具備模擬微重力環(huán)境的特性。模擬微重力環(huán)境可使細(xì)胞、組織培養(yǎng)擺脫重力的影響，實(shí)現(xiàn)更接近體內(nèi)生存環(huán)境的三維培養(yǎng)，可能更有利于細(xì)胞體外增殖和組織成熟。 本課題采用一種新型的RWVB——旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(Rotary Cell CultureSys

3、tem，RCCS)在體外模擬微重力環(huán)境，并將其應(yīng)用到組織工程產(chǎn)品制備的種子細(xì)胞體外規(guī)?；瘮U(kuò)增、組織工程骨的動(dòng)態(tài)構(gòu)建和體外培養(yǎng)成熟三個(gè)方面，以觀察模擬微重力生物反應(yīng)器對種子細(xì)胞生物學(xué)特性、組織工程骨構(gòu)建效率及體外培養(yǎng)成熟的影響，并探索采用自體血清與牛血清序貫應(yīng)用策略以降低組織工程骨中異種血清殘留量的可行性，為探索高質(zhì)量組織工程骨的規(guī)?；苽浞椒ǖ於ɑA(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)方法： 1、采用密度梯度離心與貼壁培養(yǎng)相結(jié)合的方法分離健康志愿者

4、紅骨髓、培養(yǎng)原代hMSCs，并對獲取的hMSCs進(jìn)行表面標(biāo)記物和多向分化潛能鑒定。 2、以全程自體血清培養(yǎng)和牛血清培養(yǎng)作為對照，檢測自體血清對牛血清適應(yīng)性hMSCs的增殖和成骨分化影響。 3、采用RCCS模擬微重力培養(yǎng)環(huán)境，并結(jié)合Cytodex-3微載體培養(yǎng)hMSCs，通過形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞計(jì)數(shù)、MTT及CCK-8法觀察hMSCs的生長情況，檢測培養(yǎng)液中LDH活性及葡萄糖和乳酸濃度；并檢測該培養(yǎng)方式對hMSCs成骨誘導(dǎo)分化

5、的影響。 4、觀察RCCS模擬微重力培養(yǎng)環(huán)境微載體法連續(xù)傳代培養(yǎng)hMSCs的增殖狀況和β-半乳糖苷酶染色檢測細(xì)胞老化狀況，體外連續(xù)培養(yǎng)4代后檢測細(xì)胞的致瘤性。 5、采用hMSCs與DBM支架材料構(gòu)建組織工程骨，比較RCCS模擬微重力培養(yǎng)環(huán)境中動(dòng)態(tài)接種法與常規(guī)靜置接種和纖維蛋白凝膠雙相接種法構(gòu)建組織工程骨的細(xì)胞接種效率和上架細(xì)胞密度。 6、觀察RCCS模擬微重力培養(yǎng)和常規(guī)靜置培養(yǎng)分別對組織工程骨中種子細(xì)胞的增殖和成

6、骨分化的影響。 7、采用裸鼠皮下異位成骨模型檢測不同構(gòu)建方法和不同體外培養(yǎng)時(shí)間的組織工程骨體內(nèi)成骨活性。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1、原代hMSCs接種后4d，可觀察到成纖維細(xì)胞樣的細(xì)胞集落，9至12d長滿單層培養(yǎng)瓶底，傳代細(xì)胞4至7d長滿單層；表達(dá)CDl05而不表達(dá)CD415；可誘導(dǎo)成軟骨分化；成骨誘導(dǎo)后堿性磷酸酶染色陽性，Ⅰ型膠原和骨鈣素免疫組化陽性，可形成礦化結(jié)節(jié)。 2、牛血清后序貫使用自體血清培養(yǎng)hMSCs，

7、其增殖和成骨誘導(dǎo)分化無顯著改變。 3、在RCCS模擬微重力培養(yǎng)環(huán)境中，hMSCs能在Cytodex-3微載體表面附著生長，第9d細(xì)胞數(shù)量達(dá)到峰值；細(xì)胞計(jì)數(shù)、MTT法、CCK-8法檢測結(jié)果提示：平皿培養(yǎng)hMSCs對數(shù)生長期為第2-5d，細(xì)胞數(shù)量第6d達(dá)峰值時(shí)增長到3.78倍；微重力培養(yǎng)法hMSCs對數(shù)生長期為第2-8d，第9d達(dá)到細(xì)胞峰密度時(shí)細(xì)胞數(shù)量增殖11.9倍，單位培養(yǎng)液中細(xì)胞密度較平皿組增加15.8倍，葡萄糖消耗程度及LDH

8、和乳酸濃度顯著比平皿組低。 4、微重力組與平皿組hMSCs經(jīng)成骨定向誘導(dǎo)培養(yǎng)12d，單位細(xì)胞ALP活性均達(dá)到峰值，二者無顯著差異；兩種培養(yǎng)方法獲得的細(xì)胞堿性磷酸酶染色均為陽性，Ⅰ型膠原和骨鈣素免疫組化陽性，體外培養(yǎng)都可形成鈣結(jié)節(jié)，成骨誘導(dǎo)后hMSCs的增殖速度減慢。 5、通過直接加入空白微載體的方法可實(shí)現(xiàn)RCCS微載體法培養(yǎng)hMSCs傳代培養(yǎng)，傳代細(xì)胞增殖速度略減慢，連續(xù)RCCS傳4代后hMSCs呈現(xiàn)陽性β-半乳糖苷酶陽

9、性染色；連續(xù)傳四代(RCCS培養(yǎng)57d，體外培養(yǎng)累計(jì)72d)獲得的hMSCs染色體核型正常、軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)陰性、裸鼠致瘤實(shí)驗(yàn)陰性。 6、RCCS動(dòng)態(tài)接種在1×10<'6>細(xì)胞/塊及更高密度組比靜置接種法效率高，但該方法的接種效率和組織塊所含細(xì)胞密度均比FG雙相接種法接種效率低。 7、RCCS動(dòng)態(tài)培養(yǎng)法獲得的組織塊較常規(guī)靜置培養(yǎng)法獲得更高的細(xì)胞密度峰值，組織學(xué)觀察有更多細(xì)胞外基質(zhì)成分。雙相接種法以1×10<'6>細(xì)胞/

10、塊密度接種獲得的組織工程骨在RCCS中動(dòng)態(tài)培養(yǎng)12d可達(dá)到最大細(xì)胞密度。 8、在裸鼠皮下異位成骨模型中，X線攝片、組織學(xué)觀察、免疫組化染色證實(shí)：雙相法高密度接種后經(jīng)過RCCS體外培養(yǎng)12d的組織工程骨比含相同數(shù)量種子細(xì)胞的或靜置法培養(yǎng)相同時(shí)間的組織工程骨都具有更好的成骨活性，以上3組材料均比單純DBM具有更好的體內(nèi)成骨效應(yīng)。 結(jié)論： 1．采用密度梯度離心和貼壁培養(yǎng)法分離人紅骨髓獲得的細(xì)胞在形態(tài)、表面標(biāo)志、多向分化

11、能力方面都符合hMSCs的特征，第2代hMSCs具有較高的純度和相當(dāng)?shù)臄?shù)量，是骨組織工程較理想的種子細(xì)胞；自體血清對牛血清適應(yīng)性的hMSCs體外增殖和成骨誘導(dǎo)分化無不利影響。 2．采用微載體法在RCCS模擬微重力環(huán)境中培養(yǎng)hMSCs能實(shí)現(xiàn)細(xì)胞三維培養(yǎng)、提高細(xì)胞培養(yǎng)密度、提高培養(yǎng)液利用率、促進(jìn)細(xì)胞快速增殖、實(shí)現(xiàn)(無酶消化)連續(xù)傳代、不影響成骨誘導(dǎo)分化、體外連續(xù)傳4代(共57d)仍無致瘤性，故該方法適合。hMSCs體外規(guī)?；瘮U(kuò)增。