細(xì)粒棘球絳蟲基因工程疫苗候選分子EgA31的原核表達(dá)及免疫學(xué)鑒定.pdf

1、背景與目的：包蟲病是由細(xì)粒棘球絳蟲的幼蟲引起的一種人畜共患病,在我國牧區(qū)廣泛流行,嚴(yán)重影響了牧區(qū)人民的健康并造成畜牧業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失(1,2)。目前對(duì)該病的控制主要以犬的驅(qū)蟲和對(duì)牧民的預(yù)防教育為主,但在發(fā)展中國家效果較差(3,4)。疫苗預(yù)防將是控制該病的理想途徑。理論上,通過對(duì)中間宿主(羊、牛等家畜)或終末宿主采取有效的免疫保護(hù)均能切斷細(xì)粒棘球絳蟲生活史的循環(huán)鏈,阻斷包蟲病的流行。用于中間宿主(羊)的疫苗研究方面已取得較理想的結(jié)果。Ligh

2、towlers等(12,13)報(bào)道了抗囊性包蟲病的重組疫苗 EG95,對(duì)羊的免疫保護(hù)率可達(dá)到96-100％,但由于牧區(qū)羊的數(shù)量巨大,牲畜疫苗免疫的實(shí)施費(fèi)用較高,操作繁勞,難以被社會(huì)接受。
　　犬是細(xì)粒棘球絳蟲的終末宿主,控制了犬的感染就中斷了蟲卵的傳播,從而保護(hù)中間宿主(包括人)免受感染,且牧區(qū)犬的數(shù)量遠(yuǎn)少于牛、羊等家畜,因此對(duì)終末宿主犬的免疫保護(hù)應(yīng)是非常有效的途徑。Fu等(5,6)用感染犬血清在一細(xì)粒棘球絳蟲 cDNA表達(dá)文庫中

3、篩選出一66kDa cDNA克隆 EgA31,該cDNA克隆5′端表達(dá)多肽可引起顯著的宿主體液免疫和細(xì)胞免疫。為了獲得更好的抗原性及免疫原性,本研究通過原核表達(dá)系統(tǒng)獲得 EgA31 cDNA3′端表達(dá)多肽,對(duì)其抗原性和免疫原性進(jìn)行分析、鑒定,為進(jìn)一步將 EgA31用于診斷及疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。
　　材料和方法：(1)通過 PCR方法擴(kuò)增 EgA31cDNA,將得到的cDNA片斷用限制性內(nèi)切酶酶切,然后亞克隆入 pGEX-5X-3表

4、達(dá)質(zhì)粒,鑒定、篩選陽性質(zhì)粒, DNA測(cè)序儀測(cè)序。
　　(2)將陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 Escherichia coli BL21宿主菌, IPTG誘導(dǎo)重組質(zhì)粒的表達(dá),優(yōu)化表達(dá)條件。大量表達(dá)融合蛋白,GSTrapFF柱親和層析純化表達(dá)產(chǎn)物,SDS-PAGE鑒定表達(dá)產(chǎn)物的分子量及純化效果, Bradford法測(cè)定重組蛋白含量。(3)用純化的融合蛋白免疫豚鼠,獲得抗血清, ELISA法檢測(cè)豚鼠抗體水平, Western blot法進(jìn)行分析鑒定

5、。
　　研究結(jié)果：(1) PCR擴(kuò)增得到500bp cDNA片斷,亞克隆入pGEX載體,經(jīng)酶切和 PCR方法鑒定結(jié)果表明 pGEX/EgA31重組質(zhì)粒成功構(gòu)建。測(cè)序檢驗(yàn)重組質(zhì)粒中 EgA31cDNA序列無誤。開放讀碼框正確。
　　(2) SDS-PAGE結(jié)果顯示分離純化的 EgA31/GST融合蛋白分子量大小約為45kDa,GSTrapFF柱親和層析純化表達(dá)產(chǎn)物得到較高純度的融合蛋白,蛋白表達(dá)量可達(dá)到每升培養(yǎng)基15mg重組蛋

6、白。
　　(3) ELISA結(jié)果顯示 EgA31/GST融合蛋白可激起豚鼠體內(nèi)較強(qiáng)的體液免疫反應(yīng), IgG水平明顯增高。免疫豚鼠得到的抗血清可與細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴總蛋白在66kDa處特異性反應(yīng)。并與其它蟲體蛋白之間存在交叉反應(yīng)。
　　結(jié)論：(1)成功構(gòu)建 pGEX/EgA31重組質(zhì)粒。
　　(2) EgA31/GST融合蛋白獲得高效表達(dá),并成功純化,具備被進(jìn)一步制備為工程菌的條件。
　　(3)融合蛋白可激起豚鼠較