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文檔簡(jiǎn)介
1、研究背景
紋狀體富集蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶(Striatalenrichedtyrosinephosphatases,STEP)是突觸可塑性的重要的調(diào)節(jié)因子。STEP蛋白水平和活性水平的異常將導(dǎo)致認(rèn)知障礙,造成多種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。STEP的一個(gè)最重要的下游調(diào)節(jié)因子是細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ExtracellularRegulatedProteinKinases,ERK)。ERK在細(xì)胞中調(diào)節(jié)膜電位水平的變化、樹突狀蛋白的合成、核
2、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、神經(jīng)元存活及神經(jīng)樹突的形成和穩(wěn)定[1]。因此干預(yù)STEP和ERK的相互作用對(duì)于治愈神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂有重要的治療意義。但是對(duì)于STEP特異性識(shí)別ERK的機(jī)制并沒有完全了解。因此對(duì)這一機(jī)制的研究將極大的推進(jìn)針對(duì)STEP的藥物治療。
研究目的
研究STEP去磷酸化ERK的分子機(jī)制和STEP的基本催化機(jī)制
材料與方法
將STEP野生型序列亞克隆到PET15b表達(dá)載體上,并以該表達(dá)
3、質(zhì)粒為模板構(gòu)建一系列的突變和模板。STEP及其突變和截短的表達(dá)和純化通過Ni-NTA親和柱和液相色譜進(jìn)行。STEP磷酸酶活性的檢測(cè)選擇pNPP、磷酸化短肽以及體外純化制備的磷酸化ERK蛋白作為底物。通過研究STEP不同點(diǎn)突變對(duì)底物的不同酶學(xué)催化常數(shù)Kcat、Km、Kcat/Km解釋STEP催化ERK去磷酸化的分子機(jī)制。并進(jìn)一步通過pH依賴性和解離基團(tuán)pKa依賴性的研究揭示T541在STEP催化中的作用。
結(jié)果
4、 STEP可以在體外有效的去磷酸化ERK。KIS結(jié)構(gòu)域的缺失將明顯降低STEP對(duì)底物的催化活動(dòng)。針對(duì)KIM結(jié)構(gòu)域的保守氨基酸點(diǎn)突變的酶動(dòng)力學(xué)研究STEPKIM同底物的結(jié)合模式不同于HePTP。針對(duì)F311的突變明顯降低了STEP對(duì)底物的識(shí)別和結(jié)合能力。T541通過與Q-loop和WPDloop的相互作用參與到STEP的催化過程中。
結(jié)論
STEP是高效的ERK酪氨酸磷酸酶,其催化不但需要催化區(qū)域和KIM區(qū)域的
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