成年小鼠睪丸和附睪中蛋白磷酸酶1活性檢測及其調(diào)控.pdf

1、精子的成熟過程受細胞內(nèi)蛋白質(zhì)磷酸化的調(diào)控，而蛋白質(zhì)磷酸化受蛋白激酶(英文全稱，PK)和蛋白磷酸酶(英文全稱，PP)的雙重調(diào)控。有關(guān)蛋白激酶活性調(diào)控對小鼠精子成熟的影響已有許多研究報道，但是蛋白磷酸酶活性及其調(diào)控對小鼠精子成熟的研究尚未多見。本研究的目的旨在證明小鼠精子中蛋白磷酸酶的存在及其活性的調(diào)控對小鼠精子的影響。采用6～8周齡昆明雄性小鼠為試驗材料，用PNPP試劑盒及分光光度法，進行了如下研究。 1．睪丸提取液及精液的容積對

2、蛋白磷酸酶活性的影響。將睪丸(140±10mg/mL)和精子(5～7×10<'6>個/mL)用超聲破碎儀破碎，提取上清液，分別抽取不同容積的提取液，用于蛋白磷酸酶活性分析。結(jié)果顯示，小鼠睪丸中存在較高的蛋白磷酸酶活性，隨著提取液容積的增加，蛋白磷酸酶的活性顯著(P<0.01)升高。小鼠附睪精子中蛋白磷酸酶的活性較低，但隨著精子提取液量的增加，蛋白磷酸酶活性顯著(P<0.01)升高。根據(jù)提取液容積依賴性的酶活性曲線圖，將用于酶活性反應的睪

3、丸提取液的量為5ul，精子提取液的量為為20ul。 2．睪丸組織提取液與底物的反應時間對蛋白磷酸酶活性的影響。將睪丸提取液與底物反應的時間設(shè)定為0min、10min、15min、30min、1h、1.5h、2h、2.5h、3h，觀察反應時間依賴性的酶活性曲線。結(jié)果顯示，在與底物反應半小時開始，酶活性曲線直線上升，反應兩小時候以后酶活性曲線基本達到平衡。因此，酶與底物作用時間區(qū)域在0.5～2.0 h之內(nèi)。對于酶活性較高的提取物可設(shè)

4、反應時間為30分鐘，酶活性較低的提取物可增加反應時間至1.0 h。 3．睪丸和附睪組織中蛋白磷酸酶活性的比較。采用相同重量(140±10mg/mL)的睪丸、附睪頭部和附睪尾部的提取液進行酶活性測定。結(jié)果顯示，睪丸組織蛋白磷酸酶活性最高，其次是附睪頭部，附睪尾部最低，三者之間差異極顯著(P<0.01)。 4．睪丸和附睪精子蛋白磷酸酶活性檢測。睪丸精子用Percoll梯度濃度分離法分離，附睪精子用浮游方法分離。分離后分別調(diào)節(jié)

5、濃度，經(jīng)破碎分離上清液，測定蛋白磷酸酶活性。結(jié)果顯示，睪丸精子蛋白磷酸酶活性最高，其次是附睪頭部精子，附睪尾部精子最低，三者之間差異顯著(P<0.01)。 5．睪丸精子蛋白磷酸酶1和蛋白磷酸酶2A活性檢測。花萼海綿誘癌素A(calyculin A，CA)和岡田酸(Okadaic acid，OA)是蛋白磷酸酶1(protein phosphatase 1，PP1)和蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A，PP

6、2A)的特異性抑制劑，PP1和PP2A對CA同樣敏感，而PP2A對OA的敏感性比PP1高100倍，因此根據(jù)不同濃度CA和OA對精子提取液的抑制能力，可以檢測精子提取液中PP1或PP2A的含量。分離睪丸精子，經(jīng)破碎添加CA和OA，檢測蛋白磷酸酶活性。結(jié)果顯示，當CA的濃度增加至1.0 nmol/mL時，能夠強烈抑制(84％)蛋白磷酸酶活性，繼續(xù)增加CA的濃度并沒有顯著提高抑制效果；當OA的濃度增加1.0 nmol/mL，時幾乎不抑制蛋白磷

7、酸酶活性，繼續(xù)增加OA的量，能夠逐漸可抑制蛋白磷酸酶活性，當OA濃度達到1000nmol/mL時，能夠強烈抑制蛋白磷酸酶活性(88％)。 6．附睪精子蛋白磷酸酶1和蛋白磷酸酶2A活性檢測。分離附睪頭部和尾部精子，分別添加1.0 nmol/mL CA和OA，檢測蛋白磷酸酶活性結(jié)果顯示，與未添加對照組比較，無論是附睪頭部還是尾部精于，CA添加組都能夠顯著(P<0.01)抑制蛋白磷酸酶活性(80％)，可是OA添加組僅有微弱的抑制效果。

8、 7．CA和OA對小鼠附睪精子運動能力的調(diào)控。采用浮游法分離附睪頭部和尾部精子，調(diào)節(jié)濃度為5～7×10<'6>個/mL，添加1.0 nmol/mLCA或1000 nmol/mL OA，在CO<,2>培養(yǎng)箱中孵育10分鐘(37℃，5％CO2)，顯微鏡下觀測精子運動能力。結(jié)果顯示，無論是CA還是OA都能顯著(P<0.01)提高附睪頭部和尾部精子的運動能力。 上述研究結(jié)果表明，小鼠睪丸和附睪精子中存在明顯的蛋白磷酸酶活性。特異