雙特異性磷酸酶5對滋養(yǎng)細胞增殖凋亡的影響及其相關分子機制的研究.pdf

1、背景與目的:
　　滋養(yǎng)細胞來源于形成中胚泡的滋養(yǎng)內胚層,根據(jù)其形態(tài)結構可分為:細胞滋養(yǎng)細胞、合體滋養(yǎng)細胞和中間型滋養(yǎng)細胞。滋養(yǎng)細胞增殖、分化、凋亡以及程序性入侵是人類胚胎植入、胎盤形成發(fā)育、胎兒生長發(fā)育以及妊娠順利完成的重要因素。已有研究表明,子癇前期的發(fā)生與滋養(yǎng)細胞凋亡密切相關,子癇前期患者的胎盤組織中存在滋養(yǎng)細胞凋亡過度現(xiàn)象,且胎盤滋養(yǎng)細胞的凋亡程度與子癇前期的嚴重程度呈正相關。
　　子癇前期(pre-eclampsia

2、,PE)是指妊娠20周以后出現(xiàn)高血壓、蛋白尿、水腫,并伴有全身各器官系統(tǒng)損害,是導致孕產(chǎn)婦及其圍生兒患病率和死亡率升高的重要原因之一。目前認為,子癇前期是胎盤依賴性疾病,胎盤一旦娩出,患者的相關癥狀立即消失。因其發(fā)病的迅猛性、病情的復雜性及其危害,子癇前期的病因及其發(fā)病機制的研究一直是婦產(chǎn)科領域的重要課題。目前較為公認的學說之一是滋養(yǎng)葉細胞缺血學說:即在妊娠早期,滋養(yǎng)細胞凋亡過度引起滋養(yǎng)細胞的浸潤能力下降以及血管內滋養(yǎng)細胞的轉化過程發(fā)生

3、異常,導致血管內皮細胞激活和損傷,胎盤淺著床,胎盤缺血缺氧,使得子宮螺旋小動脈生理性重鑄障礙,從而引起子癇前期相關癥狀。
　　雙特異性磷酸酶(dual specificity phosphatase,DUSP)是近年來才發(fā)現(xiàn)的,是蛋白質酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatases,PTPs)超家族的一個亞家族,因其對酪氨酸和絲/蘇氨酸具有雙特異性而備受矚目。根據(jù)其結構特征和序列的相似性可分為典型的DUS

4、P和非典型的DUSP。研究表明,現(xiàn)已知的大多數(shù)DUSP家族成員均作為絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase phosphatases,MAPK)的負向調節(jié)劑參與細胞增殖、分化、代謝、基因轉錄、離子通道、細胞-細胞通信、免疫應答等以及腫瘤的形成。
　　介于DUSP家族如此廣泛的功能,而其在滋養(yǎng)細胞的功能作用卻知之甚少,目前僅有一篇文獻報道DUSP9與胎盤發(fā)生發(fā)展及子癇前期的發(fā)生密切相關。

5、我們擬利用PCR技術繪制 DUSPs在正常早孕絨毛組織、正常晚孕胎盤組織及子癇前期胎盤組織中的動態(tài)圖譜;結合先前研究及國內外文獻,篩選出最有意義的表達差異基因----DUSP5作為本次研究的目的基因。然后擬建立 DUSP5過表達及其基因沉默的穩(wěn)定轉染細胞株,深入探討 DUSP5在滋養(yǎng)細胞增殖和凋亡中的作用,以及究竟是通過何種信號轉導通路介導滋養(yǎng)細胞增殖和凋亡,為子癇前期發(fā)病機制的闡明奠定新的分子機制,也為發(fā)展新的臨床治療策略提供可行的靶

6、點。
　　BeWo細胞系來自人絨毛膜癌組織,為人絨毛膜細胞癌株細胞系之一。相比于其它人絨毛膜細胞癌株JEG-3細胞系、JAR細胞系等,BeWo細胞系對外界刺激后,分泌人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)的能力和融合滋養(yǎng)細胞的能力與晚期妊娠絨毛滋養(yǎng)細胞更為相似。故本研究選取該細胞株作為此次實驗的體外細胞模型。
　　材料與方法:
　　(一)DUSPs在正常早孕絨毛組織、正常

7、晚孕胎盤組織和子癇前期胎盤組織中的表達差異
　　1.研究對象:2012年5月-2013年5月在我院確診并分娩的子癇前期患者的胎盤組織共20例為子癇前期組,同時期血壓正常因社會因素或骨盆異常而終止妊娠的正常晚期妊娠孕婦的胎盤組織20例為正常晚孕對照組,同時期無任何疾病或并發(fā)癥合并癥因非計劃妊娠于我院門診行人流的早孕婦女20例為正常早孕組。
　　2.實驗方法:(1)采用半定量PCR和實時定量PCR技術檢測DUSPs在三組組織中m

8、RNA的表達,并繪制DUSPs在正常早孕絨毛組織、正常晚孕胎盤組織以及子癇前期胎盤組織中的動態(tài)表達譜。
　　(2)采用Western blot技術驗證DUSP5蛋白在三組組織中的表達情況。
　　(二)DUSP5過表達及其基因沉默穩(wěn)定轉染細胞株的建立
　　1.實驗材料:正常的BeWo細胞株,DUSP5 cDNA表達慢病毒載體、DUSP5 RNAi慢病毒載體及其相應的空病毒載體
　　2.實驗方法:采用慢病毒介導方法穩(wěn)

9、定轉染 BeWo細胞株,擴大培養(yǎng)后利用流式細胞儀分選陽性細胞。采用qPCR和Western blot技術鑒定穩(wěn)定轉染細胞株是否過表達/沉默目的基因DUSP5。
　　(三)DUSP5對滋養(yǎng)細胞增殖凋亡的影響及分子機制的研究
　　1.實驗材料:正常的BeWo細胞株、DUSP5過表達的穩(wěn)定轉染細胞株、DUSP5基因沉默的穩(wěn)定轉染細胞株及轉染了相應的空病毒載體的BeWo細胞株
　　2.實驗方法:采用CCK-8實驗檢測各組滋養(yǎng)細

10、胞的增殖情況,流式細胞術檢測各組滋養(yǎng)細胞的凋亡情況;Western blot技術檢測p-ERK1/2、total-ERK1/2、p-p38、total-p38、p-JNK以及total-JNK的表達。
　　結果:
　　(一)DUSPs在正常早孕組、正常晚孕對照組和子癇前期組中的表達差異
　　1. DUSPs各基因在正常早孕組中mRNA的表達量與正常晚孕對照組相比較,均顯著增高(P<0.01);而DUSPs在子癇前期組中

11、的表達量與正常晚孕對照組相比較,呈現(xiàn)顯著的表達差異:其中 DUSP1、DUSP2、DUSP3、DUSP4、DUSP5、DUSP6、DUSP9、DUSP10及DUSP23共9個基因在子癇前期組中的表達量顯著減少(P<0.01),而DUSP8、DUSP14和DUSP22基因在子癇前期組中的表達量顯著增高(P<0.01),余下的DUSP7和DUSP16在兩組間未見明顯差異。
　　2.DUSP5蛋白在正常早孕組顯著高表達,隨著妊娠的進展在

12、正常晚孕對照組中低表達,而在子癇前期組中顯著低表達甚至缺失。
　　(二)建立DUSP5過表達及其基因沉默的穩(wěn)定轉染細胞株
　　1.經(jīng)流式細胞儀分選陽性細胞后,熒光顯微鏡觀察見DUSP5過表達組及其相應的空載體組具有明顯的紅色熒光,而 DUSP5干擾組及其相應的空載體組具有明顯的綠色熒光?？瞻讓φ战M未見任何熒光表達。
　　2.在DUSP5過表達實驗中,DUSP5過表達組中DUSP5 mRNA和蛋白的相對表達量均顯著高于空

13、白對照組和空載體組(P<0.05);在 DUSP5干擾實驗中,DUSP5干擾組中DUSP5 mRNA和蛋白的相對表達量均顯著低于空白對照組和空載體組(P<0.05)。兩組實驗中的空白對照組和相應的空載體組之間無顯著差異(P>0.05)。
　　(三)DUSP5對滋養(yǎng)細胞增殖凋亡的影響及分子機制的研究
　　1.CCK-8實驗結果:相比于相應的空載體組,DUSP5過表達組的O.D值顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),而DU

14、SP5干擾組的O.D值顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
　　2.流式細胞儀檢測凋亡結果:相比于相應的空載體組,DUSP5過表達組+DDP的早期細胞凋亡的百分數(shù)顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而DUSP5干擾組早期細胞凋亡的百分數(shù)顯著增高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。
　　3.DSUP5過表達后p-ERK1/2蛋白顯著降低(P<0.01),而DUSP5干擾后p-ERK1/2蛋白表達顯著升高(P<

15、0.01)。無論DUSP5過表達或是基因沉默,各組細胞中total-ERK1/2蛋白未見明顯變化。MAPK其他信號通路的指示蛋白p-p38、total-p38、p-JNK及total-JNK均未見明顯變化(P>0.05)。
　　4.Western blot結果:DUSP5干擾組、空載體組和空白對照組分別與U0126共培后,p-ERK1/2蛋白的表達被抑制,而未與 U0126共培養(yǎng)的相應對照組中的 p-ERK1/2蛋白正常表達,六組

16、細胞中的total-ERK1/2均未見明顯變化。
　　5.流式細胞術統(tǒng)計結果:DUSP5干擾組+U0126的早期細胞凋亡百分數(shù)(4.49±0.67％)與DUSP5干擾組+DMSO(12.67±1.00%)相比較,顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。而早期細胞凋亡百分數(shù)在空白對照組+U0126與空白對照組+DMSO中相比較以及空載體組+U0126與空載體組+DMSO中的相比較,均未見明顯變化(P>0.05)。
　　結

17、論:
　　1.成功繪制了DUSPs在正常早孕絨毛組織、正常晚孕胎盤組織及子癇前期胎盤組織中的動態(tài)圖譜,提示DUSPs與胎盤發(fā)生發(fā)育及子癇前期的發(fā)生密切相關。
　　2.成功建立DUSP5過表達及其基因沉默的穩(wěn)定轉染細胞株,為進一步研究DUSP5基因在滋養(yǎng)細胞中的功能作用提供良好的平臺。
　　3.(1) DUSP5過表達后可促進滋養(yǎng)細胞的增殖、抑制其凋亡,而DUSP5干擾后則抑制滋養(yǎng)細胞的增殖、促進其凋亡,提示DUSP5基

18、因與滋養(yǎng)細胞的增殖凋亡密切相關。
　　(2) DUSP5過表達后顯著下調p-ERK1/2的蛋白水平,而DUSP5基因沉默后顯著上調p-ERK1/2的蛋白水平,而對total-ERK1/2蛋白無明顯作用;無論DUSP5過表達還是基因沉默,其對MAPK的其它信號通路的指示蛋白p-p38、total-p38、p-JNK及total-JNK均無明顯作用。提示DUSP5對滋養(yǎng)細胞增殖凋亡的影響可能是通過調節(jié)MAPK ERK1/2信號通路實現(xiàn)