人胚胎干細胞的優(yōu)化培養(yǎng)以及向神經(jīng)干細胞的分化研究.pdf

1、華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文人胚胎干細胞的優(yōu)化培養(yǎng)以及向神經(jīng)干細胞的分化研究姓名：許慧芳申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：神經(jīng)病學(xué)指導(dǎo)教師：張?zhí)K明20090506華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文64Ⅳ型膠原酶法傳代是兩株人胚胎干細胞在HAFi飼養(yǎng)層傳代的最佳方式。操作簡單、污染幾率小、對細胞的生長影響也較低，不足之處在于會攜帶部分飼養(yǎng)層細胞同時傳代。結(jié)論結(jié)論HAFi細胞可以用做兩株中國人胚胎干細胞培養(yǎng)的飼養(yǎng)層，取代MEF后解決了動物源

2、性細胞混雜和異源污染問題，省卻了飼養(yǎng)層原代細胞的培養(yǎng)步驟同時解決了由不同批次飼養(yǎng)層差異帶來的培養(yǎng)體系的不穩(wěn)定。本實驗還初步提示了兩株中國人胚胎干細胞與歐美國家建系的干細胞有所不同。關(guān)鍵詞關(guān)鍵詞人胚胎干細胞飼養(yǎng)層永生化人成體成纖維細胞第二部分第二部分人胚胎干細胞無飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系的建立與鑒定人胚胎干細胞無飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系的建立與鑒定目的目的建立兩株中國人胚胎干細胞無飼養(yǎng)層的培養(yǎng)體系，從根本上純化干細胞。方法方法用基質(zhì)膠（Matrigel）作為

3、細胞外基質(zhì)。分別使用MEF和HAFi飼養(yǎng)層上清獲得的條件培養(yǎng)基（MEFCM，HAFiCM），添加TGFβ1、Noggin和不同濃度bFGF的單因子非條件培養(yǎng)基以及FT、FTN、FTNI、TNI等多因子聯(lián)合非條件培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。觀察細胞在不同無飼養(yǎng)層體系的生長情況，用流式細胞術(shù)檢測細胞分化率，統(tǒng)計細胞傳代周期，從而對不同的無飼養(yǎng)層體系和因子作用做出評估；比較不同MEF飼養(yǎng)層密度獲得的MEFCM以及不同的傳代方法對干細胞生長的影響；對所得干

4、細胞進行基本性質(zhì)的鑒定。結(jié)果結(jié)果1.兩株中國人胚胎干細胞可以在MEFCM、FM160、FM250以及FT、FTN、FTNI等多因子聯(lián)合培養(yǎng)基與基質(zhì)膠共同構(gòu)建的無飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系中生長。2.6105mL—12105mL的MEF飼養(yǎng)層密度適合獲取MEFCM。3.機械法傳代可以用于hESC從飼養(yǎng)層到無飼養(yǎng)層的轉(zhuǎn)移步驟，Ⅳ型膠酶法傳代可以用于無飼養(yǎng)層的長期傳代。4.流式細胞檢測未分化率MEFCMFTNI≈FTNFTFM160≈FM250TNI5.