人胚胎干細(xì)胞向原始精原細(xì)胞誘導(dǎo)分化的機(jī)制研究.pdf

1、獲得早期發(fā)育人原始精原細(xì)胞對(duì)于研究精子發(fā)生過(guò)程及深入研究男性不育的病理機(jī)制具有重要意義。但是由于取材困難，在體研究的不安全性及倫理限制等問(wèn)題使其一直成為困擾學(xué)者研究的難題。自1998年第一株人胚胎干細(xì)胞（hESCs，human embryonic stem cells）成功建系以來(lái)，鑒于其在體外有無(wú)限增殖、自我更新及向各類細(xì)胞分化的特性，有關(guān)它的多潛能性維持與誘導(dǎo)分化的機(jī)制研究得到許多學(xué)者的關(guān)注。因此，體外通過(guò)誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞向精原細(xì)胞

2、分化進(jìn)而探索原始精原細(xì)胞發(fā)育的過(guò)程，不僅可以避免上述諸多問(wèn)題的困擾，而且對(duì)于我們深入認(rèn)識(shí)精子發(fā)生與男性不育，同時(shí)為臨床藥物的研發(fā)及篩選建立可靠模型等工作的開展提供堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)。
　　目前雖已有文獻(xiàn)報(bào)道將hESCs誘導(dǎo)成原始精原細(xì)胞的研究，這其中包括有添加誘導(dǎo)分化因子，比如骨形態(tài)生成蛋白4（BMP4, bone morphogenetic protein4）、BMP7、 BMP8b、干細(xì)胞因子（SCF, stem cell fac

3、tor）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF, epidermal growth factor）、神經(jīng)膠質(zhì)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（ GDNF, glial cell line-derived neurotrophic factor）及視黃酸（RA, retinoic acid）等，或者與人源/鼠源睪丸基質(zhì)細(xì)胞來(lái)源的條件培養(yǎng)基進(jìn)行共培養(yǎng)，亦有通過(guò)在hESCs中過(guò)表達(dá)DAZL或者VASA(也稱作DDX4)進(jìn)而聯(lián)合誘導(dǎo)分化因子等方法。但是這些方法因?yàn)榇嬖谟姓T導(dǎo)步

4、驟繁瑣，重復(fù)性差，周期過(guò)長(zhǎng)，機(jī)制不清楚或者由于慢病毒載體本身帶來(lái)的安全問(wèn)題等尚存在一定的爭(zhēng)議與討論。
　　2012年，有學(xué)者使用小分子化合物（small molecular compound）對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞進(jìn)行重編成為化學(xué)藥物誘導(dǎo)的多潛能干細(xì)胞（CiPSCs, chemically induced piuripotent stem cells），當(dāng)時(shí)引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注與討論。CHIR99021作為其中之一，是常見的糖原合成

5、激酶（GSK3, glycogen synthase kinase3）的抑制劑，近年來(lái)被報(bào)道在參與胚胎干細(xì)胞多潛能性維持方面，或者促進(jìn)胚胎干細(xì)胞/誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞（iPSCs, induced pluripotent stem cells）體外向心肌細(xì)胞，腎源性細(xì)胞，原始的腎臟近端管狀細(xì)胞等中內(nèi)胚層的分化過(guò)程中均起著重要的調(diào)節(jié)作用。視黃酸（RA, retinoic acid）是由維生素A氧化代謝產(chǎn)生的一種具有生物活性的產(chǎn)物，在細(xì)胞的增殖

6、與分化、器官形成及內(nèi)穩(wěn)態(tài)的平衡（視力調(diào)節(jié)、生殖系統(tǒng)、免疫反應(yīng)）等生命活動(dòng)中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用。在體實(shí)驗(yàn)研究表明RA在精子發(fā)生過(guò)程及調(diào)控減數(shù)分裂的發(fā)生中均起著重要的誘導(dǎo)功能。同樣體外RA在hESCs或者是iPSCs向原始精原細(xì)胞方向的誘導(dǎo)分化中也發(fā)揮著不可替代的作用。目前尚沒(méi)有聯(lián)合CHIR99021和RA促進(jìn)hESCs向原始精原細(xì)胞的誘導(dǎo)分化的相關(guān)報(bào)道。
　　近年來(lái)有學(xué)者報(bào)道Wnt信號(hào)通路對(duì)于哺乳動(dòng)物睪丸的發(fā)育過(guò)程中起著重要的作用

7、，其中包括對(duì)PGCs的特定化、增殖、遷移、精原干細(xì)胞（SSCs， spermatogonia stem cells）的維持及精子發(fā)生過(guò)程調(diào)控均有緊密的關(guān)系。但是對(duì)于體外誘導(dǎo)原始精原分化過(guò)程中，Wnt信號(hào)通路是否有參與及如何發(fā)揮作用目前尚沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。
　　本文就上述研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)問(wèn)題從以下三個(gè)方面進(jìn)行相關(guān)研究：第一部分：小分子化合物（CHIR99021）聯(lián)合視黃酸（retinoic acid）作用于hESCs促進(jìn)原始精原細(xì)胞的產(chǎn)

8、生及單倍體細(xì)胞的出現(xiàn)；第二部分：Wnt/β-catenin信號(hào)通路在CHIR99021誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向原始精原細(xì)胞分化中的作用；第三部分：IWR-1阻斷由CHIR99021與RA聯(lián)合誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向原始精原細(xì)胞分化。
　　第一部分：小分子化合物（CHIR99021）聯(lián)合視黃酸（retinoic acid）作用于hESCs促進(jìn)原始精原細(xì)胞產(chǎn)生及單倍體細(xì)胞的出現(xiàn)
　　目的：
　　檢測(cè)小分子化合物（CHIR99021）聯(lián)合視

9、黃酸（retinoic acid）對(duì)于體外hESCs向原始精原細(xì)胞誘導(dǎo)分化的作用。
　　方法：
　　通過(guò)immunofluorescence，western blotting，flow cytometry，Real-time-qPCR, synaptonemal complex protein(SCP) straining, fluorescence in situ hybridization(FISH)的方法，探索CHIR

10、99021聯(lián)合RA以不同的作用順序及作用時(shí)間對(duì)hESCs向精原細(xì)胞的誘導(dǎo)分化中的過(guò)程的影響。
　　結(jié)果：
　　1.細(xì)胞免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明8μM的CHIR99021作用于hESCs3天時(shí)間之后，單獨(dú)添加9天的2μM RA作用的序貫培養(yǎng)方法及聯(lián)合12天8μM CHIR99021與2μM RA共同作用的方法在促進(jìn)DAZL蛋白的表達(dá)效果是顯著的。
　　2.通過(guò)Real-time-qPCR的方法直接證實(shí)上述兩組誘導(dǎo)方法的組

11、合使DDX4、Blimp1、Nanos、TFAP2C基因在 mRNA水平的表達(dá)明顯增高,western blotting也證實(shí)DDX4蛋白的表達(dá)量相比較于未分化組顯著增多。另外頂體蛋白-中間體（acrosin-intermediate）的表達(dá)量也是呈現(xiàn)顯著增加。同時(shí)β-catenin在兩組中的表達(dá)量也是呈現(xiàn)明顯增多的。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析 DAZL，c-Kit，CXC趨化因子受體4（CXCR4）陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)都是呈現(xiàn)顯著升高。
　　3.

12、采用聯(lián)會(huì)絲復(fù)合體蛋白（synaptonemal complex protein, SCP3）細(xì)胞免疫熒光染色的方法證實(shí)點(diǎn)狀的SCP3蛋白的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組；同時(shí)熒光原位雜交技術(shù)（ fluorescence in situ hybridization, FISH）證實(shí)使用常染色體探針（Chr16/22）檢測(cè)兩個(gè)誘導(dǎo)組均出現(xiàn)單倍體細(xì)胞。
　　結(jié)論：
　　3 d CHIR99021聯(lián)合9 d RA和12 d CHIR99021

13、與RA共培養(yǎng)的方法對(duì)于促進(jìn)人胚胎干細(xì)胞體外定向分化為原始精原細(xì)胞分化有明顯作用，另外該方法可達(dá)到體外向更為成熟的減數(shù)分裂期及單倍體細(xì)胞形成的水平。
　　第二部分 Wnt/β-catenin信號(hào)通路在CHIR99021誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向原始精原細(xì)胞分化中的作用
　　目的：
　　探索使用CHIR99021與RA在促進(jìn)hESCs向原始精原細(xì)胞誘導(dǎo)分化的機(jī)理。
　　方法：
　　采用immunofluorescence

14、的方法，檢測(cè)hESCs在添加CHIR99021第0天和第3天OCT4與β-catenin的熒光強(qiáng)度所發(fā)生的變化。同時(shí)采用PCR Array實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)Wnt信號(hào)通路中相關(guān)基因的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　相比較于第0天hESCs的OCT4熒光強(qiáng)度，作用3天CHIR99021之后的hESCs發(fā)生明顯的降低，這說(shuō)明 hESCs已經(jīng)發(fā)生了分化，在作用3天的CHIR99021的hESCs組中，統(tǒng)計(jì)有40％的細(xì)胞中β-catenin發(fā)

15、生入核。通過(guò)對(duì)兩個(gè)誘導(dǎo)組與未分化組之間進(jìn)行PCR array比較分析后發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)APC、Axin1、Axin2表達(dá)量呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)，其中WNT10A、WNT2、WNT2B、WNT3、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT9A顯著上調(diào)表達(dá)， TCF7作為Wnt-β-catenin胞內(nèi)重要元件，在該過(guò)程中呈現(xiàn)顯著上調(diào)表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　β-catenin在作用3天CHIR99021的hESCs發(fā)生明顯的

16、入核現(xiàn)象充分說(shuō)明經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路被激活，PCR Array分析實(shí)驗(yàn)更加佐證該結(jié)論。
　　第三部分 IWR-1阻斷由CHIR99021與RA聯(lián)合誘導(dǎo)干細(xì)胞向原始精原細(xì)胞分化
　　目的：
　　采用Wnt/β-catenin信號(hào)通路的抑制劑IWR-1作用于上述誘導(dǎo)組中，進(jìn)而檢測(cè)在該誘導(dǎo)方法下β-catenin是否發(fā)生明顯的入核現(xiàn)象及是否有DAZL陽(yáng)性細(xì)胞的出現(xiàn)。
　　方法：
　　采用細(xì)胞免疫

17、熒光的化學(xué)方法進(jìn)行檢測(cè)在IWR-1分別作用于3天CHIR99021及12天CHIR99021與RA共培養(yǎng)組進(jìn)而觀察β-catenin和DAZL的熒光變化情況。
　　結(jié)果：
　　相比較于未分化hESCs，OCT4的熒光強(qiáng)度在3d CHIR99021+IWR-1共培養(yǎng)組發(fā)生明顯降低，同時(shí)β-catenin并未發(fā)生入核，同時(shí)，相比較與12d CHIR99021+RA共培養(yǎng)組，DAZL蛋白并未在12d CHIR99021+RA+IW