小鼠和人胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞的分化.pdf

1、隨著老齡化時代的來臨,神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病越來越引起了社會的廣泛關(guān)注。研究胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells,ES細(xì)胞)的體外神經(jīng)分化,得到大量的神經(jīng)前體細(xì)胞和特定類型的神經(jīng)元,有望為早期神經(jīng)發(fā)育的研究、神經(jīng)藥理和毒理研究以及神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的細(xì)胞替代治療提供研究模型和細(xì)胞來源。本研究針對小鼠和人ES細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞的分化進行了研究,主要包括了以下兩方面的工作:
　　 (一)小鼠ES細(xì)胞的神經(jīng)分化:我們研究的重點

2、和創(chuàng)新體現(xiàn)在密度對小鼠ES細(xì)胞神經(jīng)分化的效率和細(xì)胞類型的研究上。本研究發(fā)現(xiàn),小鼠ES細(xì)胞在無血清的培養(yǎng)環(huán)境里,ES細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時的接種密度對類胚體(embryonic body,EB)質(zhì)量有很大的影響并影響隨后的神經(jīng)分化效率:當(dāng)小鼠ES細(xì)胞以較低密度(1×105 ES cells/ml)懸浮培養(yǎng)時,得到的EB形態(tài)較為均一,呈規(guī)則的圓形,EB的形態(tài)較緊密,邊界亮而光滑,這樣的EB貼壁培養(yǎng)后,神經(jīng)分化的效率較高,Nestin陽性細(xì)胞約占92

3、％；小鼠ES細(xì)胞以較高密度(1×106 ES cells/ml)懸浮培養(yǎng)時,EB的大小不均一,形態(tài)不規(guī)則,邊界不光滑,這樣的EB貼壁培養(yǎng)后,神經(jīng)分化的效率較低,Nestin陽性細(xì)胞約占50％。本研究還發(fā)現(xiàn),EB貼壁培養(yǎng)時的接種密度也影響分化得到的神經(jīng)細(xì)胞類型:EB低密度貼壁培養(yǎng)后長出的細(xì)胞更傾向于表達(dá)后腦和脊髓特異性的定位基因Hoxb4、Hoxb9。
　　 (二)人ES細(xì)胞的神經(jīng)分化:首先我們采用EB法進行了人ES細(xì)胞的神經(jīng)誘導(dǎo)

4、分化,并且我們對該EB進行了改進,從而提高了誘導(dǎo)效率。我們的誘導(dǎo)方案的創(chuàng)新性主要體現(xiàn)在兩個方面:一是在EB形成階段,用化學(xué)成分明確的促進神經(jīng)細(xì)胞增殖的培養(yǎng)基替代了以往報道中選用的含血清的培養(yǎng)基從而提高了誘導(dǎo)效率；二是在EB貼壁后長出的玫瑰花結(jié)樣結(jié)構(gòu),我們用機械法挑取代替了以往報道中所采用的差別酶消化法從而提高了目的細(xì)胞的純度。我們的實驗結(jié)果顯示,這些改進可以明顯提高人ES細(xì)胞的神經(jīng)誘導(dǎo)效率。盡管通過以上實驗方法的改進,我們用EB法誘導(dǎo)人

5、ES細(xì)胞的神經(jīng)分化得到了較好的實驗結(jié)果,但在實驗過程中發(fā)現(xiàn)類胚體法有很多不足之處。單層貼壁誘導(dǎo)法是一種新的神經(jīng)誘導(dǎo)方法,細(xì)胞的分化較同步；而且細(xì)胞的形態(tài)改變易于觀察,細(xì)胞的分化進展易于通過免疫組織化學(xué)染色等實驗手段實時監(jiān)測。本研究在BMP4的抑制劑Noggin的作用下,應(yīng)有單層貼壁誘導(dǎo)法高效地把人ES細(xì)胞誘導(dǎo)成了神經(jīng)細(xì)胞,且神經(jīng)發(fā)生的時間早于EB法。我們的研究還初步證實,單層貼壁誘導(dǎo)法的早期即添加FGF8和SHH可以大大促進多巴胺能神經(jīng)