HMME-PDT對(duì)牙菌斑生物膜活性及結(jié)構(gòu)的影響.pdf

1、目的：
　　齲病是一種發(fā)生于牙體硬組織的由口腔常在菌引起的內(nèi)源性感染性疾病，在各種疾病的發(fā)病率中，齲病位居前列。我國第三次全國口腔健康流行病學(xué)抽樣調(diào)查結(jié)果顯示，現(xiàn)在最突出的口腔健康問題表現(xiàn)在齲齒上：5歲兒童乳牙齲齒的患病率為66％，35～44歲中年人齲齒患病率為88.1％，65～74歲老年人齲齒患病率高達(dá)98.4％。不僅如此，齲病及其并發(fā)的牙髓病和根尖周病是口腔科就診率最高的病種。鑒于齲病的常見性和多發(fā)性，齲病預(yù)防的意義遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于被

2、動(dòng)治療。
　　齲病發(fā)生、發(fā)展的過程只有依靠牙菌斑才能介導(dǎo)和完成。因此，通過適當(dāng)?shù)姆椒ㄓ绊懷谰呱锬?nèi)細(xì)菌的生長代謝，干擾牙菌斑形成或促使牙菌斑解離，即可達(dá)到預(yù)防齲病的目的。本實(shí)驗(yàn)首先通過應(yīng)用波長532nm的半導(dǎo)體激光器和光敏劑血卟啉單甲醚(hematoporphyrinmonomethylether，HMME)對(duì)四種主要致齲菌混合菌懸液進(jìn)行光動(dòng)力治療，探討光動(dòng)力療法(PhotodynamicTherapy，PDT)對(duì)致齲菌是否具

3、有殺滅作用，并篩選出PDT的最佳效應(yīng)參數(shù)；體外建立混合菌菌斑生物膜進(jìn)行光動(dòng)力實(shí)驗(yàn)，探討PDT對(duì)菌斑生物膜結(jié)構(gòu)、細(xì)菌活性和產(chǎn)酸能力的影響，并驗(yàn)證單線態(tài)氧在HMME-PDT殺菌過程中的作用。
　　方法：
　　1.變形鏈球菌、血鏈球菌、嗜酸性乳桿菌和粘性放線菌分別于37℃厭氧環(huán)境中培養(yǎng)48h復(fù)蘇，制備成1×108CFU/mL的混合菌懸液備用。
　　2.混合菌懸液分別與濃度為10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、60

4、μg/ml的HMME37℃黑暗中孵育5分鐘后，應(yīng)用波長532nm半導(dǎo)體激光器照射30s、60s、90s、120s，處理完畢進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，與對(duì)照組進(jìn)行比較，選擇PDT最佳效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)參數(shù)，為下一步的菌斑生物膜模型實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。
　　3.體外環(huán)境下，選擇四種口腔主要致齲菌在牙釉質(zhì)表面形成混合菌菌斑生物膜。實(shí)驗(yàn)分為5組：HMME-PDT組、HMME-PDT加疊氮鈉組、單純疊氮鈉處理組、陽性對(duì)照西吡氯銨處理組、陰性對(duì)照生理鹽水處理組。根據(jù)平

5、板菌落計(jì)數(shù)和24小時(shí)內(nèi)PH值測定結(jié)果觀察HMME-PDT對(duì)菌斑生物膜內(nèi)細(xì)菌活性和產(chǎn)酸能力的影響。通過激光共聚焦顯微鏡(ConfocalLaserScanMicroscope，CLSM)觀察HMME-PDT對(duì)菌斑生物膜結(jié)構(gòu)的影響。
　　結(jié)果：
　　1.混合菌菌懸液實(shí)驗(yàn)平板菌落計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，在本實(shí)驗(yàn)條件下，HMME－PDT對(duì)致齲菌最佳效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)參數(shù)為：光敏劑HMME濃度40μg/ml，波長532nm、功率密度0.14W/cm2半

6、導(dǎo)體激光器連續(xù)照射90s。
　　2.根據(jù)HMME-PDT對(duì)混合菌菌斑生物膜中細(xì)菌作用的平板菌落計(jì)數(shù)結(jié)果顯示：與陰性對(duì)照生理鹽水處理組相比，單純疊氮鈉組對(duì)混合菌菌斑生物膜中細(xì)菌的生長幾乎沒有影響(P>0.05)；西吡氯銨處理組可使混合菌菌斑生物膜內(nèi)細(xì)菌數(shù)量減少(P<0.05)，殺菌率為51.86％；而HMME-PDT組可使混合菌菌斑生物膜內(nèi)細(xì)菌的數(shù)量顯著減少(P<0.05)，殺菌率高達(dá)94.92％；HMME-PDT+疊氮鈉組對(duì)混合菌

7、菌斑生物膜中細(xì)菌的殺滅作用不明顯(P>0.05)，殺菌率僅為9.47％。
　　3.由24小時(shí)內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)不同處理組上清液的pH值結(jié)果可以看出，與生理鹽水處理組相比，HMME-PDT及西吡氯銨處理均可使混合菌菌斑生物膜內(nèi)細(xì)菌產(chǎn)酸能力顯著降低，其⊿pH(pH的變化幅度)明顯減小(P<0.05)；HMME-PDT組與西吡氯銨處理組相比仍有顯著性差異(P<0.05)，且在HMME-PDT處理24h后培養(yǎng)物上清的pH值為6.01，高于致齲臨

8、界pH值(5.0～5.5)；HMME-PDT+疊氮鈉組和單純疊氮鈉處理組對(duì)生物膜內(nèi)細(xì)菌代謝產(chǎn)酸沒有顯著影響，⊿pH值無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　4.CLSM斷層掃描圖像顯示：生理鹽水處理組菌斑生物膜底層和表層細(xì)菌較少、較稀疏；中間層細(xì)菌明顯增多，密集，層疊如棉絮狀；三維重建圖像可見生物膜結(jié)構(gòu)致密，有一定厚度，中間有許多暗黑的管道系統(tǒng)。HMME-PDT處理后的菌斑生物膜底層和表層幾乎無細(xì)菌存在；中間層有少許細(xì)菌存活，細(xì)菌之間

9、間隙較大，呈星點(diǎn)樣散布；菌斑生物膜整體結(jié)構(gòu)稀疏分散，未形成典型的三維立體結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)論：
　　1.HMME-PDT對(duì)混合菌菌懸液有明顯的殺傷作用，殺傷效果與光敏劑濃度、激光照射時(shí)間有著密切的關(guān)系。
　　2.HMME-PDT可以明顯降低菌斑生物膜中細(xì)菌的活性并抑制其代謝產(chǎn)酸。
　　3.單線態(tài)氧在HMME-PDT殺菌過程中起著極其重要的作用。
　　4.HMME-PDT可以破壞菌斑生物膜結(jié)構(gòu)的完整性，促進(jìn)其解離