沙門菌生物膜形成的影響因素及機制研究.pdf

1、第一部分鼠傷寒沙門菌質粒對細菌生物膜形成的影響
　　目的：
　　鼠傷寒沙門菌（Salmonella typhimurium，S.typhimurium）在多種物體表面形成的生物膜（Biofilm，BF）對增強其致病性有重要作用。本研究探討鼠傷寒沙門菌SR-11攜帶的100kb質粒對細菌在不同材質表面BF形成的影響，為后續(xù)進一步探討該質粒的致病機制及抗菌藥物的研制提供理論和實驗依據(jù)。
　　方法：
　　1.BF形成適

2、宜培養(yǎng)基的選擇
　　以攜帶質粒的鼠傷寒沙門菌野生株SR-11為受試菌，將對數(shù)生長期菌液分別接種于含肉湯培養(yǎng)基（Luria-Bertani，LB）和胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（Tryptose Soya Broth，TSB）的聚苯乙烯96孔培養(yǎng)板及置小圓玻片于底部的24孔培養(yǎng)板，30℃培養(yǎng)6h、12h、24 h和48h后用結晶紫半定量法比較在聚苯乙烯培養(yǎng)板與玻片表面BF形成的適宜培養(yǎng)基。
　　2.帶有綠色熒光蛋白GFP菌株的構建及

3、生長曲線的測定
　　參照文獻將GFP基因導入攜帶100kb質粒的鼠傷寒沙門菌野生株SR-11和將該質粒消除后的突變株，構建帶有綠色熒光蛋白GFP標記的發(fā)光菌。將對數(shù)生長期菌液稀釋后涂布于含100μg/ml氨芐青霉素（Ampicillin，Amp）的LB固體培養(yǎng)基上，熒光顯微鏡下觀察。用構建的野生株與突變株單克隆分別接種于LB培養(yǎng)基后測定細菌生長曲線。
　　3.鼠傷寒沙門菌質粒對細菌在不同材質表面BF形成的影響
　　按上

4、述條件，將野生株和突變株分別在聚苯乙烯培養(yǎng)板與玻片表面建立BF模型。結晶紫半定量法比較受試菌6h、12h、24h和48h在兩種材質表面BF形成的差異；共聚焦激光掃描顯微鏡（Confocal laser scanning microscopy，CLSM）斷層掃描，比較受試菌在玻片表面BF的形成。
　　結果：
　　1.BF形成適宜培養(yǎng)基的選擇
　　結晶紫半定量法結果顯示，野生株在聚苯乙烯培養(yǎng)板和玻片兩種材質表面用LB培養(yǎng)基

5、各時間點的OD590值均高于TSB培養(yǎng)基，說明LB培養(yǎng)基更適宜BF的形成，在后續(xù)實驗中即選擇LB培養(yǎng)基。
　　2.帶有綠色熒光蛋白GFP菌株的構建及生長曲線的測定
　　熒光顯微鏡檢測結果顯示，用Amp選擇培養(yǎng)基能篩選出表達GFP的野生株與突變株。與未導入GFP基因的菌株相比，細菌生長曲線未受明顯影響。
　　3.鼠傷寒沙門菌質粒對細菌在不同材質表面BF形成的影響
　　結晶紫半定量法結果顯示，6h、12h、24h和4

6、8h聚苯乙烯培養(yǎng)板表面生長的野生株與突變株OD590值均未見統(tǒng)計學差異（P>0.05）；在玻片表面生長的野生株OD590值各時間點均高于突變株（P<0.01）；野生株和突變株更易在聚苯乙烯培養(yǎng)板表面形成BF。CLSM觀察結果顯示，30℃靜態(tài)培養(yǎng)48h后，野生株在玻片表面可形成融合成片的菌膜，平均厚度和最大厚度分別是25μm與30μm；突變株僅形成稀疏的菌落，平均厚度和最大厚度分別為15μm與18μm。
　　結論：
　　鼠傷寒

7、沙門菌SR-11攜帶的100kb質粒能促進宿主菌在玻片表面BF的形成，但對聚苯乙烯培養(yǎng)板表面BF的形成未見明顯影響，說明BF的形成除與細菌的胞外黏附成份相關外還與其生成的材質表面結構相關。
　　第二部分胞外DNA對沙門菌生物膜形成的影響及其機制研究
　　目的：
　　通過檢測鼠傷寒沙門菌SR-11與傷寒沙門菌ST6生物膜（Biofilm，BF）胞外DNA（Extracellular DNA，eDNA）的含量及來源，研究其

8、在細菌BF形成和維持BF結構穩(wěn)定性中的作用，為后續(xù)防治沙門菌感染、抗菌藥物和消毒劑的研制提供理論和實驗依據(jù)。
　　方法：
　　1.BF中eDNA的檢測
　　(1)eDNA的分子量測定和定量分析
　　將對數(shù)生長期的SR-11和ST6菌液接種于含LB肉湯的聚苯乙烯6孔板，30℃靜態(tài)培養(yǎng)，于6h、12h、24h和48h用細胞刮刀收集BF樣本，分別用蛋白酶K和纖維素酶消化提取eDNA，瓊脂糖凝膠電泳法測定eDNA的分子量

9、并用紫外分光光度計對eDNA進行定量分析。
　　(2)CLSM觀察eDNA在BF中的定位
　　將對數(shù)生長期的SR-11與ST6菌液接種于含LB培養(yǎng)基的24孔板中，置小圓玻片于24孔板底部，30℃靜態(tài)培養(yǎng)48 h。DDAO[7-hydroxy-9H-(1，3-dichloro-9，9-dimethylacridin)，DDAO]染色后用CLSM觀察熒光顏色的變化以確定eDNA在BF中的定位。
　　2.eDNA對細菌BF形

10、成及三維結構的穩(wěn)定作用
　　(1)微量平板法
　　將對數(shù)生長期的SR-11和ST6菌液接種至含LB培養(yǎng)基的聚苯乙烯96孔培養(yǎng)板中，同時加入終濃度為50μg/ml的DNase I，另設未加DNase I作陰性對照，30℃靜態(tài)培養(yǎng)48h。結晶紫半定量法分別在6h、12h、24h和48h各時間點檢測DNase I對BF形成的影響。
　　將對數(shù)生長期的SR-11和ST6菌液接種至含LB培養(yǎng)基的聚苯乙烯96孔培養(yǎng)板中，并加入用前

11、法提取的分別來自各菌的eDNA（終濃度5μg/ml），另設未加eDNA作陰性對照，30℃靜態(tài)培養(yǎng)48h。結晶紫半定量法分別在6h、12h、24h和48h各時間點檢測eDNA對BF形成的影響。
　　將對數(shù)生長期的SR-11和ST6菌液接種至含LB液體培養(yǎng)基的聚苯乙烯96孔板中，30℃靜態(tài)培養(yǎng)48h后加入50μg/ml DNase I，另設未加DNase I作陰性對照。用結晶紫半定量法檢測DNase I對BF結構完整性的影響。

12、　　(2)CLSM觀察法
　　將對數(shù)生長期的帶有綠色熒光蛋白GFP標記的SR-11和ST6菌液分別接種于含LB培養(yǎng)基的24孔板中，置小圓玻片于24孔板底部，并加入50μg/ml DNase I，另設未加DNase I作陰性對照，30℃靜態(tài)培養(yǎng)48h后CLSM觀察DNase I對BF形成的影響。
　　將對數(shù)生長期的帶有GFP標記的SR-11和ST6菌液接種于含LB培養(yǎng)基的24孔板中，置小圓玻片于24孔板底部，30℃靜態(tài)培養(yǎng)48

13、h后加入50μg/ml DNase I，另設未加DNase I作陰性對照，CLSM觀察DNase I對受試菌BF三維結構的穩(wěn)定作用。
　　(3)DNase I對BF中活菌數(shù)的影響
　　將稀釋至OD600為0.05的SR-11和ST6菌液接種于6孔板中。實驗組加入50μg/ml DNase I，另設未加DNase I作陰性對照，30℃靜態(tài)培養(yǎng)48h。分別將菌液和形成于管壁的菌膜用梯度稀釋平板菌落計數(shù)法對游離狀態(tài)和固著狀態(tài)的細菌

14、進行計數(shù)，觀察DNase I對兩種狀態(tài)下細菌生長的影響。
　　3.RAPD-PCR檢測eDNA的來源
　　用隨機擴增多態(tài)DNA聚合酶鏈式反應（Random amplified polymorphic DNA PCR，RAPD-PCR）分析eDNA的來源。用酚氯仿法提取細菌基因組DNA，用兩種引物（P1254：5’-CCGCAGCCAA-3’，23L：5’-CCGCAGCCAA-3’）分別對SR-11和ST6的eDNA與基因組

15、DNA進行擴增，瓊脂糖凝膠電泳分析eDNA來源。
　　結果：
　　1.BF中eDNA的檢測
　?。?）SR-11與ST6 BF中均含有eDNA，瓊脂糖凝膠電泳顯示其相對分子量均大于10.0kb。隨時間延長，細菌BF中eDNA含量均逐漸增加，SR-11形成的BF中eDNA明顯多于ST6（P<0.01）。
　　（2）SR-11和ST6 BF培養(yǎng)48h用DDAO染色后，CLSM觀察發(fā)現(xiàn)SR-11形成的BF中，在表達GF

16、P的活菌和裂解的紅色死菌輪廓中有成片的紅色eDNA；ST6 BF中僅見稀疏散在的紅色eDNA。
　　2.eDNA對細菌BF形成及三維結構的穩(wěn)定作用
　　（1）結晶紫半定量法結果顯示，用微量平板在培養(yǎng)受試菌時加入50μg/ml DNase I，SR-11和ST6培養(yǎng)12h后實驗組形成的BF明顯多于對照組（P<0.01）。在受試菌培養(yǎng)時加入5μg/ml的eDNA，SR-11和ST6培養(yǎng)12h后實驗組形成的BF均明顯少于對照組（P

17、<0.01）。受試菌培養(yǎng)48h后加入50μg/ml DNase I，實驗組與對照組未見明顯差異（P>0.05）。
　　（2）CLSM觀察結果顯示，受試菌培養(yǎng)液中加入50μg/ml DNase I，靜態(tài)培養(yǎng)48h后在小圓玻片底部均能形成大片狀密集的BF，鋪滿整個玻片底部；陰性對照組僅有稀疏散在的菌落。在細菌培養(yǎng)48h后加入50μg/ml DNase I，實驗組與對照組未見明顯差異。
　?。?）受試菌培養(yǎng)液中加入50μg/ml

18、DNase I靜態(tài)培養(yǎng)48 h后，活菌計數(shù)結果顯示，SR-11和ST6游離狀態(tài)的細菌中兩實驗組和陰性對照組的活菌數(shù)未見明顯差異（P>0.05），BF中固著狀態(tài)的細菌中兩實驗組均明顯多于陰性對照組（P<0.01）；
　　3.RAPD-PCR檢測eDNA的來源
　　RAPD-PCR結果顯示，SR-11和ST6的eDNA與細菌基因組DNA擴增片段基本相同，說明eDNA來源于細菌裂解后釋放的基因組DNA。
　　結論：