傷寒沙門菌質(zhì)粒對(duì)細(xì)菌生物膜形成的影響及分子機(jī)制研究.pdf

1、研究傷寒沙門菌(Salmonella enterica serovar Typhi，S.typhi)質(zhì)粒pRST98與細(xì)菌生物膜(biofilm，BF)形成的關(guān)系，探討其與細(xì)菌密度感知系統(tǒng)(quorum-sensing，QS)相互作用的分子機(jī)制，為后續(xù)防治沙門菌感染及新藥靶位的發(fā)現(xiàn)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.傷寒沙門菌質(zhì)粒對(duì)生物膜形成的影響
　　 (1)生物膜形成適宜溫度和時(shí)間的確定
　　

2、 用攜帶pRST98的傷寒沙門菌野生株ST8于30℃和37℃培養(yǎng)3d，用半定量法確定BF形成的最適溫度。將稀釋的菌液于30℃分別培養(yǎng)12 h、1d、2d、3d、4d和5d，用半定量法確定BF成熟的時(shí)間。
　　 (2)傷寒沙門菌不同菌株生物膜形成的比較
　　 分別用攜帶pRST98的傷寒沙門菌野生株ST8、消除pRST98的突變株ST8-△pRST98和將pRST98經(jīng)接合轉(zhuǎn)移重新導(dǎo)入ST8-△pRST98所獲得的回補(bǔ)株

3、ST8-c-pRST98，按上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定的條件建立BF模型。分別用結(jié)晶紫染色法、半定量法、掃描電鏡(scanning electron microscopy，SEM)觀察和共聚焦激光顯微鏡(confocal laserscanning microscopy，CLSM)斷層掃描比較受試菌形成BF的差異。
　　 (3)傷寒沙門菌不同菌株對(duì)HeLa細(xì)胞粘附的比較
　　 將實(shí)驗(yàn)菌株ST8、ST8-△pRST98和ST8-c-

4、pRST98按感染復(fù)數(shù)(multiplicity ofinfection，MOI)100:1與HeLa細(xì)胞共培養(yǎng)1h后，收集細(xì)胞用PBS洗滌破膜后平板菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)集落形成單位(colony-forming unit，CFU)比較受試菌對(duì)細(xì)胞的粘附力。
　　 2.傷寒沙門菌質(zhì)粒與細(xì)菌密度感知系統(tǒng)相互作用的分子機(jī)制
　　 將實(shí)驗(yàn)菌株ST8、ST8-△pRST98和ST8-c-pRST98分為兩組：一組加入1μM/mL的QS

5、系統(tǒng)信號(hào)分子?；呓z氨酸內(nèi)酯(N-acylhomoserine lactones，AHLs)商品化藥物辛?；呓z氨酸內(nèi)酯(N-octanoyl-L-homoserine lactone，C8-AHLs)；另一組加入等量的生理鹽水(normal saline，NS)作為對(duì)照，分別進(jìn)行下述實(shí)驗(yàn)。
　　 (1)AHLs對(duì)受試菌粘附的影響
　　 將受試菌按感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)10

6、0:1與HeLa細(xì)胞共培養(yǎng)，1h后收集細(xì)胞用PBS洗滌破膜后用平板菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)CFU比較受試菌對(duì)細(xì)胞的粘附力。
　　 (2)AHLs對(duì)受試菌抗血清殺菌能力的影響
　　 將受試菌液濃度調(diào)整至104 CFU/ml，分別與兔和豚鼠血清37℃共作用2h后，用平板菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)CFU比較受試菌的存活數(shù)。
　　 (3)AHLs對(duì)受試菌rck基因轉(zhuǎn)錄水平的影響
　　 將兩組細(xì)菌37℃靜置培養(yǎng)1 h，藥物和細(xì)菌充分作用

7、后分別提取細(xì)菌的總RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)，檢測(cè)AHLs對(duì)補(bǔ)體殺菌抗性基因(resistance to complement killing genes，rck)mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.沙門菌質(zhì)粒對(duì)生物膜形成的影響
　　 (1)生物膜形成適宜溫度和時(shí)間的確定：菌株ST83

8、0℃培養(yǎng)比37℃形成BF能力強(qiáng)。30℃培養(yǎng)3d后BF生長(zhǎng)趨于穩(wěn)定，故選擇30℃培養(yǎng)3d作為測(cè)定BF形成的條件。
　　 (2)傷寒沙門菌不同菌株生物膜形成的比較：結(jié)晶紫染色、SEM及CLSM觀察顯示，傷寒沙門菌中野生株ST8和回補(bǔ)株ST8-c-pRST98均形成BF，而消除pRST98的傷寒沙門菌ST8-△pRST98未見明顯BF形成。半定量法測(cè)定顯示，ST8和ST8-c-pRST98的OD570值均大于ST8-△pRST98，差

9、異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，ST8與ST8-c-pRST98的OD570值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　 (3)傷寒沙門菌不同菌株對(duì)HeLa細(xì)胞的粘附比較：ST8、ST8-△pRST98和ST8-c-pRST98對(duì)HeLa細(xì)胞的粘附率未見明顯差異(P>0.05)。
　　 2.傷寒沙門菌質(zhì)粒與密度感知系統(tǒng)相互作用的分子機(jī)制
　　 (1)AHLs對(duì)受試菌粘附的影響：AHLs干預(yù)組ST8及ST8-c-pRST

10、98對(duì)HeLa細(xì)胞的粘附率均高于ST8-△pRST98，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，ST8及ST8-c-pRST98對(duì)HeLa細(xì)胞的粘附率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；對(duì)照組ST8、ST8-△pRST98和ST8-c-pRST98對(duì)HeLa細(xì)胞的粘附率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；兩組間ST8+AHLs與ST8-c-pRs r98+AHLs對(duì)HeLa細(xì)胞的粘附率分別高于ST8+NS和ST8-c-pRST98+NS(P<0.05)，而ST8-△pR

11、sr98+AHLs與ST8-△pRST98+NS對(duì)HeLa細(xì)胞的粘附率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　 (2)AHLs對(duì)受試菌抗血清殺菌能力的影響：AHLs干預(yù)組ST8和ST8-c-pRST98在兔和豚鼠血清中的存活率明顯高于ST8-△pRST98(P<0.01)；對(duì)照組ST8和ST8-c-pRST98在兔和豚鼠血清中的存活率高于ST8-△pRST98(P<0.05)；兩組中ST8和ST8-c-pRST98在兔和豚鼠血清中的

12、存活率均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；兩組間ST8+AHLs與ST8-c-pRST98+AHLs在兔和豚鼠血清中的存活率分別高于ST8+NS和ST8-c-pRST98+NS(P<0.05)，而ST8-△pRST98+AHLs與ST8-△pRST98+NS在兔和豚鼠血清中的存活率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　 (3)AHLs對(duì)受試菌rck基因轉(zhuǎn)錄水平的影響：RT-PCR結(jié)果顯示，AHLs干預(yù)組ST8和ST8-c-pRST98