HMME-PDT對(duì)兔血管平滑肌細(xì)胞的殺傷作用及機(jī)制的研究.pdf

1、本課題選用HMME做光敏劑，532nm激光為光源，研究不同不同光敏劑劑量及不同激光照射劑量的光動(dòng)力學(xué)作用對(duì)兔血管平滑肌細(xì)胞的影響，用MTT法、臺(tái)盼藍(lán)法檢測(cè)及形態(tài)學(xué)觀察研究HMME-PDT對(duì)VSMC細(xì)胞的殺傷作用，用流式細(xì)胞儀等觀察細(xì)胞凋亡的情況，用流式細(xì)胞儀和共聚焦顯微鏡等方法觀察活性氧物質(zhì)的產(chǎn)生、HMME在細(xì)胞內(nèi)的分布以及細(xì)胞骨架的變化來(lái)探討HMME-PDT誘導(dǎo)凋亡的可能機(jī)制。為臨床提出一種預(yù)防血管成形術(shù)后血管再狹窄新方法并設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)相

2、應(yīng)的專用激光治療設(shè)備提供依據(jù)。 材料與方法： 1 材料 1.1試劑 光敏劑HMME由上海第二醫(yī)科大學(xué)藥物研究所提供，工作液濃度為10μ g/ml，由不含血清的RPMI 1640新鮮配制。Annexin V/PI雙染試劑盒購(gòu)自羅氏公司。Rohdamine 123，DCFH-DA，Hoechst33342和FITC-phalloidin購(gòu)自Molecular Probes公司。臺(tái)盼蘭和MTT購(gòu)自SIGMA公司

3、。RPMll640培養(yǎng)基購(gòu)自SIGMA公司。胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司，經(jīng)熱原處理。 1.2儀器 光源為光纖耦合半導(dǎo)體激光器，由武漢凌云光電科技有限責(zé)任公司生產(chǎn)，輸出激光波長(zhǎng)532nm。激光功率計(jì)為加拿大Gentec公司產(chǎn)品。激光共聚焦掃描顯微鏡為德國(guó)ZEISS公司產(chǎn)品。流式細(xì)胞儀為美國(guó)Beckman coulter公司產(chǎn)品。 2方法 2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 兔經(jīng)靜脈注射空氣處死，開(kāi)胸取

4、胸至腹段主動(dòng)脈約12cm，沿血管縱軸剪開(kāi)，刮除內(nèi)膜，取動(dòng)脈中層剪成碎塊后貼于細(xì)胞培養(yǎng)瓶底，加入含10﹪胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，置于37℃、5﹪CO<,2>孵箱內(nèi)孵育，5天后換液，待10～12天后組織塊周圍形成"細(xì)胞暈"時(shí)傳代。 2.2光動(dòng)力作用 在處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞中加入10μg/ml HMME孵育2h，倒棄培養(yǎng)液，PBS清洗后加入新鮮含10﹪血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，即刻進(jìn)行照光。激光功率密度為10m

5、W/cm<'2>。 2.3檢測(cè)HMME-PDT對(duì)細(xì)胞增殖的抑制 體外培養(yǎng)的兔血管平滑肌細(xì)胞，以每孔1×10<'5>個(gè)細(xì)胞均勻接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔1ml，貼壁24h，之后用不含血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，使細(xì)胞周期同步化。然后加入不同終濃度的光敏劑在37℃避光孵育2h，再用PBS洗3次，加入完全培養(yǎng)基，即刻進(jìn)行激光照射。照光后將培養(yǎng)板放置在培養(yǎng)箱繼續(xù)避光培養(yǎng)6h或24h，MTT法和臺(tái)盼藍(lán)排除法檢測(cè)各組細(xì)胞吸光度，計(jì)算各組

6、細(xì)胞存活率或抑制率。 2.4.形態(tài)學(xué)觀察 體外培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞，以每孔5×10<'5>個(gè)細(xì)胞均勻接種于內(nèi)置小玻片的24孔培養(yǎng)板中，貼壁24h。PDT組加入10μg/ml的光敏劑HMME，激光照射能量密度為2.4J/cm<'2>?？瞻讓?duì)照組未加任何處理。光動(dòng)力學(xué)作用后，再培養(yǎng)24h，分別進(jìn)行HE染色光鏡觀察、Hoechst 33342染色熒光顯微鏡觀察，拍照。 2.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 體外培養(yǎng)的V

7、SMC細(xì)胞均勻接種6孔培養(yǎng)板中，貼壁24h。PDT組加入10μg/ml光敏劑HMME，激光照射能量密度為2.4J/cm<'2>?？瞻讓?duì)照組未加任何處理。光動(dòng)力學(xué)作用后，再培養(yǎng)24h，收集各組細(xì)胞，Annexin V/PI雙染，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率和壞死率。 2.6激光共聚焦顯微鏡觀察HMME在細(xì)胞內(nèi)的亞定位將 細(xì)胞接種于專用的35mm Petri培養(yǎng)皿。細(xì)胞貼壁后，分別用HMME和線粒體熒光探針Rhodamine

8、123進(jìn)行孵育，然后用PBS緩沖液沖洗3次，加入1ml PBS維持細(xì)胞的生理狀態(tài)。置于共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察。 2.7流式細(xì)胞儀檢測(cè)ROS的產(chǎn)生 體外培養(yǎng)的VSMC細(xì)胞均勻接種6孔培養(yǎng)板中，貼壁24h。PDT組加入10.μg/ml光敏劑HMME，激光照射能量密度為2.4J/cm<'2>?？瞻讓?duì)照組未加任何處理。光動(dòng)力學(xué)作用后，選取0～4h內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)，收集各組細(xì)胞，DCFH-DA染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的含量。

9、 2.8觀察PDT處理后細(xì)胞骨架的變化 <1>考馬斯亮藍(lán)染色法體外培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞，以每孔5×10<'5>個(gè)細(xì)胞均勻接種于內(nèi)置小玻片的24孔培養(yǎng)板中，貼壁24h。PDT組加入10μg/ml的光敏劑HMME，激光照射能量密度分別為1.2 J/cm<'2>、2.4.J/cm<'2>、4.8 J/cm<'2>?？瞻讓?duì)照組未加任何處理。光動(dòng)力學(xué)作用后，再培養(yǎng)24h，常規(guī)考馬斯亮藍(lán)染色，光鏡下觀察，拍照。 <2>FITC

10、-phalloidin熒光染色法將細(xì)胞接種于專用的35mm Petri培養(yǎng)皿，貼壁24h。PDT組加入10μg/ml的光敏劑HMME，激光照射能量密度為2.4J/cm<'2>。空白對(duì)照組未加任何處理。光動(dòng)力學(xué)作用后，再培養(yǎng)30min、2h和24h，固定，抽提，封閉、FITC-phalloidin和Hoechst33342染色，激光共聚焦顯微鏡下觀察。 2.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，SPSS 13.0軟件

11、包分析樣本，采用單因素方差分析法進(jìn)行分析，p<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1.單純激光照射組和單純光敏劑組的細(xì)胞存活率和空白對(duì)照組比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，即單純激光照射和單純光敏劑孵育對(duì)VSMC細(xì)胞增殖無(wú)明顯的抑制作用。各PDT組細(xì)胞存活率和空白對(duì)照組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，即PDT對(duì)VSMC細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用。PDT對(duì)VSMC細(xì)胞增殖的抑制與光敏劑濃度和激光照射劑量在一定范圍內(nèi)呈正比關(guān)系。即隨著光敏劑濃度的增加

12、和激光劑量的加大，細(xì)胞的抑制率隨之增加。細(xì)胞半數(shù)致死劑量為HMME濃度10μg/ml及激光能量密度2.4J/cm<'2>.HE染色和熒光顯微鏡結(jié)果也顯示HMME-PDT作用細(xì)胞后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯的變化，細(xì)胞呈凋亡或壞死樣改變。 2.流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，HMME-PDT可誘導(dǎo)VSMC細(xì)胞發(fā)生凋亡和壞死，其凋亡率達(dá)到50.5﹪。 3.通過(guò)激光共聚焦顯微鏡的檢測(cè)，觀察到HMME的熒光與線粒體的熒光有重疊。顯示HMME在線粒

13、體內(nèi)有分布。 4.ROS檢測(cè)結(jié)果顯示PDT作用后不同時(shí)間段細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生可分為兩個(gè)階段：第一個(gè)上升期是在PDT后30min，1h后開(kāi)始下降；第二個(gè)上升期是PDT后2h。即PDT后確有ROS的升高，且其升高呈現(xiàn)雙峰。 5.考馬斯亮藍(lán)染色法結(jié)果顯示正常組細(xì)胞的細(xì)胞正常細(xì)胞的細(xì)胞骨架分布均勻有致，肌絲清晰可見(jiàn)，在膜周和核周濃集。而PDT組細(xì)胞隨著劑量的增大，依次出現(xiàn)了肌絲排列紊亂、收縮、斷裂等現(xiàn)象，并在核周濃集，有部分形成

14、了凋亡小體。共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示PDT后30min熒光圖象變暗，肌絲模糊，而在2h時(shí)，綠色熒光重新變亮，圍繞核呈環(huán)狀排列，并且核開(kāi)始固縮，這說(shuō)明肌動(dòng)蛋白發(fā)生了解聚和重排。PDT后24h細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡狀態(tài)。 結(jié)論： 1.用不同濃度的光敏劑HMME(5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml)以及不同能量密度的532nm激光(0.3 J/cm<'2>、0.6 J/cm<'2>、1.2 J/cm<'2>、2.4 J/

15、cm<'2>、4.8 J/cm<'2>)對(duì)兔血管平滑肌細(xì)胞進(jìn)行光動(dòng)力學(xué)處理，均可對(duì)細(xì)胞的增殖產(chǎn)生明顯的抑制作用，并在一定的劑量范圍內(nèi)呈明顯的劑量依賴性。單純光敏劑或單純激光照射對(duì)細(xì)胞的增殖無(wú)抑制作用。 2.波長(zhǎng)為532nm的半導(dǎo)體激光聯(lián)合HMME的光動(dòng)力學(xué)作用可誘導(dǎo)兔血管平滑肌細(xì)胞的凋亡。 3.光敏劑HMME在兔血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)可定位于線粒體。 4.血卟啉單甲醚光動(dòng)力學(xué)療法作用于兔血管平滑肌細(xì)胞VSMC后，產(chǎn)生了