咪喹莫特對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥和Th2型趨化因子，STAT6表達(dá)的影響.pdf

1、支氣管哮喘是一種以嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，氣道高反應(yīng)性，間斷發(fā)作的氣流阻塞，免疫球蛋白(Ig)E升高為特征的慢性氣道炎癥。CD4+T淋巴細(xì)胞在哮喘發(fā)病中起重要作用?；诩?xì)胞因子表達(dá)譜的不同，CD4+T淋巴細(xì)胞至少分為兩型，即Th1和Th2淋巴細(xì)胞。哮喘發(fā)作時(shí)，Th2細(xì)胞因子如IL-4、IL-13和IL-5明顯增高，Th1細(xì)胞因子如IL-12、IFN-γ下降。目前認(rèn)為哮喘最重要的免疫學(xué)異常在于Th1/Th2亞群數(shù)目和(或)功能失衡。糾正這種失衡

2、的免疫學(xué)反應(yīng)是控制哮喘發(fā)作的一個(gè)重要研究方向。 近年來(lái)，一組小分子量的免疫調(diào)節(jié)劑咪唑喹琳胺家族問(wèn)世，咪喹莫特是該家族成員之一，它能結(jié)合于天然免疫系統(tǒng)的細(xì)胞TLR7、8受體上，誘導(dǎo)Th1細(xì)胞因子產(chǎn)生，具有抗病毒和抗腫瘤的作用。咪喹莫特的同類(lèi)物resiquimod與OVA共同刺激B細(xì)胞，能增加OVA-特異性IgG2α和抑制IgE的合成。以上研究表明咪喹莫特可能對(duì)以Th2免疫反應(yīng)占優(yōu)勢(shì)的支氣管哮喘有治療作用。 第一部分：咪喹莫

3、特對(duì)致敏小鼠脾T淋巴細(xì)胞的調(diào)節(jié)研究 目的：觀察咪喹莫特對(duì)致敏小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用。方法BALB/C小鼠用卯蛋白致敏兩次后，用尼龍毛柱法分離脾臟T細(xì)胞，將細(xì)胞分為三組，分別為空白對(duì)照組，卵蛋白組和咪喹莫特組，各組細(xì)胞孵育不同的時(shí)間后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組Th1和Th2細(xì)胞的比例。結(jié)果空白對(duì)照組分化為T(mén)h1和Th2細(xì)胞比例均較低。卵蛋白組分化為T(mén)h1和Th2的細(xì)胞均增多，至24小時(shí)，Th1/Th2為0.42。咪喹莫特組孵育至

4、24小時(shí)，Th1/Th2為1.83，Th1細(xì)胞數(shù)較卵蛋白組明顯增多，Th2細(xì)胞數(shù)較卵蛋白組明顯降低。結(jié)論咪喹莫特能抑制致敏T淋巴細(xì)胞向Th2方向分化，促進(jìn)致敏T淋巴細(xì)胞向Th1方向分化。 第二部分咪喹莫特對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥和Th2趨化因子、STAT6表達(dá)的影響 目的：觀察咪喹莫特對(duì)小鼠哮喘模型氣道炎癥和肺組織Th2型趨化因子Eotaxin、MDC、TARC及趨化因子受體CCR3、CCR4，轉(zhuǎn)錄因子STAT6表達(dá)的影響。方

5、法將40只BALB/C小鼠分成4組，分別為對(duì)照組，哮喘組，咪喹莫特組，地塞米松組，每組10只。OVA霧化結(jié)束后24h，測(cè)定對(duì)乙酰膽堿的氣道反應(yīng)性；小鼠眼球摘除采血收集血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血清中Eotaxin、MDC和TARC水平；收集BALF進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類(lèi)，測(cè)定BALF中IL-4和IFN-γ；H-E染色觀察肺組織炎癥改變；用免疫組化方法檢測(cè)肺組織Eotaxin、MDC、TARC、CCR3和CCR4的表達(dá)；用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反

6、應(yīng)半定量方法檢測(cè)肺組織IL-4、IFN-γ、Eotaxin、MDC、TARC、CCR3、CCR4、STAT1和STAT6mRNA表達(dá)水平。結(jié)果(1)咪喹莫特組小鼠氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性較哮喘組明顯減輕。(2)哮喘組小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)及各種炎癥細(xì)胞較正常組顯著增加，咪喹莫特治療組嗜酸性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞比哮喘組明顯減少。(3)咪喹莫特治療組小鼠血清Eotaxin、MDC和TARC水平較哮喘組下降。(4)咪喹莫特治療組小鼠肺組織Eotax

7、in、MDC、TARC、CCR4、IL-4和STAT6蛋白和mRNA表達(dá)較哮喘組降低，比正常組表達(dá)增加。結(jié)論霧化吸入咪喹莫特可在一定程度上減輕哮喘小鼠的氣道炎癥和氣道反應(yīng)性，抑制肺組織Eotaxin、MDC、TARC、CCR4、IL-4和STAT6蛋白和mRNA的過(guò)度表達(dá)。 第三部分、咪喹莫特對(duì)氣道上皮細(xì)胞A549TARC表達(dá)的影響 目的：觀察咪喹莫特對(duì)氣道上皮細(xì)胞TARC表達(dá)有無(wú)作用及這種作用是否與STAT6有關(guān)。方法

8、A549細(xì)胞分別與細(xì)胞因子和藥物共同孵育4、16、24、48和72小時(shí)。用ELISA方法測(cè)定培養(yǎng)液中TARC水平；RT-PCR方法測(cè)定A549細(xì)胞TARCmRNA表達(dá)；westerblot方法測(cè)定A549細(xì)胞STAT6和P-STAT6水平。結(jié)果IL-4和IL-13單獨(dú)刺激A549細(xì)胞，培養(yǎng)液中TARC水平低于最低檢測(cè)值，當(dāng)聯(lián)合TNF-α?xí)r，隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，TARC水平明顯升高，到72小時(shí)達(dá)到最大值。咪喹莫特能顯著抑制A549細(xì)胞TA