咪喹莫特對(duì)哮喘小鼠TLR7 mRNA及氣道炎癥因子的影響.pdf

1、背景和目的：支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱哮喘)是一種以氣道反應(yīng)性增高,可逆性氣流受阻,黏膜高分泌和血清高IgE為特點(diǎn)的氣道慢性炎癥性疾病。其實(shí)質(zhì)是以氣道嗜酸性粒細(xì)胞、Th2細(xì)胞和肥大細(xì)胞浸潤(rùn)為主,其特征是Th1/Th2細(xì)胞免疫失衡以及Th2細(xì)胞占優(yōu)勢(shì),進(jìn)而促進(jìn)Th2細(xì)胞因子IL-4、IL-13等的產(chǎn)生,誘導(dǎo)以IgE依賴的超敏反應(yīng)和嗜酸性炎癥。近年來(lái),我國(guó)哮喘的發(fā)病率、住院率及死亡率逐年增加,嚴(yán)重威脅人們特別是兒童的身體健康。據(jù)調(diào)查,在我國(guó)哮喘患者至

2、少達(dá)2000萬(wàn)以上,哮喘的患病率約為1％,其中兒童高達(dá)3%。
　　 Toll樣受體(Toll like receptors,TLRs)是一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)受體,能識(shí)別自然界中微生物的病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecularpatterns,PAMPs),能調(diào)節(jié)機(jī)體的先天性和獲得性免疫反應(yīng)。TLRs對(duì)Th1/Th2免疫平衡和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能起著重要調(diào)節(jié)作用,在哮喘的發(fā)展機(jī)制中發(fā)揮重要功能

3、[3-4]。CD4+T細(xì)胞是過(guò)敏反應(yīng)性氣道炎癥的主要效應(yīng)細(xì)胞,分為T(mén)h1型和Th2型兩大類。Th1細(xì)胞主要分泌IFN-r,IL-12等因子,而Th2細(xì)胞主要分泌IL-4,IL-13等因子。IL-12是刺激Th0細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化的最有力的細(xì)胞因子,能調(diào)節(jié)Th1/Th2免疫反應(yīng),刺激Th1型細(xì)胞因子尤其是IFN-r的分泌,抑制Th2細(xì)胞的功能和IgE的產(chǎn)生,誘導(dǎo)肺內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞的凋亡,降低氣道高反應(yīng)性。IL-13是一種主要由Th2細(xì)胞分

4、泌的多效性細(xì)胞因子,調(diào)節(jié)Th1和Th2細(xì)胞反應(yīng)類型,促使嗜酸性粒細(xì)胞的募集并減少其凋亡,促進(jìn)IgE分泌,在哮喘等過(guò)敏性疾病中發(fā)揮重要作用[4]。有研究表明小兒哮喘的發(fā)病機(jī)制與T淋巴細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子息息相關(guān),Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞在數(shù)目、活化程度、功能方面的比例失衡是造成哮喘氣道變應(yīng)性炎癥的主要因素。Th1型細(xì)胞數(shù)目減少或功能低下即產(chǎn)生IL-12不足,而Th2型細(xì)胞數(shù)目增多或功能亢進(jìn)即IL-13分泌增加,將促使B細(xì)胞合成IgE的作用

5、增強(qiáng)。IL-12、IL-13及IgE等細(xì)胞因子在哮喘發(fā)病機(jī)理和免疫調(diào)節(jié)中越來(lái)越重要。
　　 咪喹莫特類藥物是一種新型的小分子免疫調(diào)節(jié)劑,它能啟動(dòng)機(jī)體的免疫反應(yīng)系統(tǒng),促進(jìn)Th1類細(xì)胞因子和IgG2的產(chǎn)生并抑制Th2類細(xì)胞因子和IgE的產(chǎn)生。TLR7是Toll樣受體家族中的重要成員之一,有研究表明TLR7能特異性識(shí)別咪喹莫特,能誘導(dǎo)Th1細(xì)胞因子的分泌,抑制Th2細(xì)胞因子的產(chǎn)生,從而減輕氣道炎癥,維持機(jī)體的免疫平衡,但其作用機(jī)制尚不

6、十分明確。
　　 由于目前國(guó)內(nèi)關(guān)于TLR7及其配體咪喹莫特治療哮喘免疫機(jī)制的研究不多,故本課題通過(guò)RT-PCR法測(cè)定哮喘小鼠模型中肺組織TLR7mRNA的表達(dá)水平,ELISA法測(cè)定肺泡灌洗液(BALF)中IL-12、IL-13及血清中OVA-IgE的濃度,來(lái)探討咪喹莫特治療哮喘的主要免疫機(jī)制,為進(jìn)一步治療哮喘提供新的研究方法。
　　 材料和方法：
　　 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組鼠齡為4周的雌性BALB/C純系小鼠30只

7、,SPF級(jí),體重為15-20g,隨機(jī)分為正常組,哮喘組,咪喹莫特組,每組各10只。
　　 2.模型制備
　　 哮喘組:在第1天、第7天、第14天分別予小鼠腹腔注射OVA致敏液(含OVA100ug和氫氧化鋁凝膠400ug)0.1ml,21天后以10%OVA溶液超聲霧化激發(fā)30min,持續(xù)7天。咪喹莫特組:在哮喘組的基礎(chǔ)上,在霧化吸入10%OVA溶液前1h預(yù)先吸入0.15%咪喹莫特混懸液30min,連續(xù)7天。正常組:用等量的

8、生理鹽水代替OVA致敏液霧化激發(fā)小鼠,方法同哮喘組。
　　 3.實(shí)驗(yàn)測(cè)定
　　 取各組小鼠左上葉肺組織,4%中性多聚甲醛固定,進(jìn)行石蠟切片、HE染色,收集支氣管肺泡灌洗液,進(jìn)行肺泡灌沈液(BALF)細(xì)胞分離、計(jì)數(shù)及IL-12、IL-13水平的檢測(cè);采取眼球血進(jìn)行血清IgE的水平的測(cè)定;取出右上葉肺組織進(jìn)行TLR7 mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)。
　　 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 使用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各組數(shù)據(jù)

9、進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)的形式來(lái)表示,3組小鼠問(wèn)的數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析,數(shù)掘間的兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn),P＜0.05表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.病理結(jié)果
　　 光鏡下,正常組小鼠支氣管管壁無(wú)增厚,無(wú)異常的分泌物,氣管粘膜下及肺泡腔內(nèi)無(wú)炎性滲出物及炎癥細(xì)胞滲出。哮喘組小鼠細(xì)支氣管的管壁平滑肌增生增厚,支氣管分泌物增加,纖毛上皮細(xì)胞脫落,排列紊亂,周圍組織水腫,微血管通透

10、性增加,血管和支氣管周圍組織見(jiàn)較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn),以嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主。與哮喘組相比,咪喹莫特組小鼠的炎性細(xì)胞及炎性滲出物等均有所減少。
　　 2.肺泡灌洗液中細(xì)胞計(jì)數(shù)與分類在肺泡灌洗液中,哮喘組小鼠的細(xì)胞總數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞與正常組比較明顯增加,而咪喹莫特治療組小鼠較哮喘組有所減輕(P＜0.05)。
　　 3.各組小鼠肺泡灌沈液中IL-12、IL-13和血清中IgE水平在肺泡灌沈液中,哮喘組小鼠IL-12

11、水平較正常組減少,咪喹莫特組IL-12高于哮喘組但低于正常組(P＜0.05);哮喘組小鼠中的IL-13水平較正常組升高,咪喹莫特組IL-13與哮喘組比較降低(P＜0.05),但較正常組升高;哮喘組小鼠血清中的IgE水平較正常組顯著升高,而咪喹莫特組中的IgE水平明顯低于哮喘組,但高于正常組;IL-12與IgE呈負(fù)相關(guān)(r=-0.802),而IL-13與IgE呈正相關(guān)(r=0.774)。
　　 4.各組小鼠肺TLR7 mRNA基因

12、的表達(dá)哮喘組小鼠肺組織TLR7 mRNA基因的表達(dá)低于正常組,咪喹莫特組小鼠肺組織TLR7 mRNA基因的表達(dá)明顯高于哮喘組和正常組(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.霧化吸入咪喹莫特能上調(diào)Th1細(xì)胞因子IL-12水平且IL-12與血清IgE水平呈負(fù)相關(guān),還能下調(diào)Th2細(xì)胞因子IL-13水平且IL-13與IgE水平呈正相關(guān),使免疫反應(yīng)偏向Th1型,從而減輕氣道炎癥反應(yīng)與及高反應(yīng)性;
　　 2.霧化吸入咪喹