咪喹莫特對哮喘小鼠TLR7 mRNA及氣道炎癥因子的影響.pdf

1、背景和目的：支氣管哮喘(簡稱哮喘)是一種以氣道反應性增高,可逆性氣流受阻,黏膜高分泌和血清高IgE為特點的氣道慢性炎癥性疾病。其實質是以氣道嗜酸性粒細胞、Th2細胞和肥大細胞浸潤為主,其特征是Th1/Th2細胞免疫失衡以及Th2細胞占優(yōu)勢,進而促進Th2細胞因子IL-4、IL-13等的產生,誘導以IgE依賴的超敏反應和嗜酸性炎癥。近年來,我國哮喘的發(fā)病率、住院率及死亡率逐年增加,嚴重威脅人們特別是兒童的身體健康。據調查,在我國哮喘患者至

2、少達2000萬以上,哮喘的患病率約為1％,其中兒童高達3%。
　　 Toll樣受體(Toll like receptors,TLRs)是一種新發(fā)現的細胞跨膜轉導受體,能識別自然界中微生物的病原相關分子模式(pathogen-associated molecularpatterns,PAMPs),能調節(jié)機體的先天性和獲得性免疫反應。TLRs對Th1/Th2免疫平衡和調節(jié)性T細胞的功能起著重要調節(jié)作用,在哮喘的發(fā)展機制中發(fā)揮重要功能

3、[3-4]。CD4+T細胞是過敏反應性氣道炎癥的主要效應細胞,分為Th1型和Th2型兩大類。Th1細胞主要分泌IFN-r,IL-12等因子,而Th2細胞主要分泌IL-4,IL-13等因子。IL-12是刺激Th0細胞向Th1細胞分化的最有力的細胞因子,能調節(jié)Th1/Th2免疫反應,刺激Th1型細胞因子尤其是IFN-r的分泌,抑制Th2細胞的功能和IgE的產生,誘導肺內嗜酸性粒細胞的凋亡,降低氣道高反應性。IL-13是一種主要由Th2細胞分

4、泌的多效性細胞因子,調節(jié)Th1和Th2細胞反應類型,促使嗜酸性粒細胞的募集并減少其凋亡,促進IgE分泌,在哮喘等過敏性疾病中發(fā)揮重要作用[4]。有研究表明小兒哮喘的發(fā)病機制與T淋巴細胞及其分泌的細胞因子息息相關,Th1細胞和Th2細胞在數目、活化程度、功能方面的比例失衡是造成哮喘氣道變應性炎癥的主要因素。Th1型細胞數目減少或功能低下即產生IL-12不足,而Th2型細胞數目增多或功能亢進即IL-13分泌增加,將促使B細胞合成IgE的作用

5、增強。IL-12、IL-13及IgE等細胞因子在哮喘發(fā)病機理和免疫調節(jié)中越來越重要。
　　 咪喹莫特類藥物是一種新型的小分子免疫調節(jié)劑,它能啟動機體的免疫反應系統(tǒng),促進Th1類細胞因子和IgG2的產生并抑制Th2類細胞因子和IgE的產生。TLR7是Toll樣受體家族中的重要成員之一,有研究表明TLR7能特異性識別咪喹莫特,能誘導Th1細胞因子的分泌,抑制Th2細胞因子的產生,從而減輕氣道炎癥,維持機體的免疫平衡,但其作用機制尚不

6、十分明確。
　　 由于目前國內關于TLR7及其配體咪喹莫特治療哮喘免疫機制的研究不多,故本課題通過RT-PCR法測定哮喘小鼠模型中肺組織TLR7mRNA的表達水平,ELISA法測定肺泡灌洗液(BALF)中IL-12、IL-13及血清中OVA-IgE的濃度,來探討咪喹莫特治療哮喘的主要免疫機制,為進一步治療哮喘提供新的研究方法。
　　 材料和方法：
　　 1.實驗動物和分組鼠齡為4周的雌性BALB/C純系小鼠30只

7、,SPF級,體重為15-20g,隨機分為正常組,哮喘組,咪喹莫特組,每組各10只。
　　 2.模型制備
　　 哮喘組:在第1天、第7天、第14天分別予小鼠腹腔注射OVA致敏液(含OVA100ug和氫氧化鋁凝膠400ug)0.1ml,21天后以10%OVA溶液超聲霧化激發(fā)30min,持續(xù)7天。咪喹莫特組:在哮喘組的基礎上,在霧化吸入10%OVA溶液前1h預先吸入0.15%咪喹莫特混懸液30min,連續(xù)7天。正常組:用等量的

8、生理鹽水代替OVA致敏液霧化激發(fā)小鼠,方法同哮喘組。
　　 3.實驗測定
　　 取各組小鼠左上葉肺組織,4%中性多聚甲醛固定,進行石蠟切片、HE染色,收集支氣管肺泡灌洗液,進行肺泡灌沈液(BALF)細胞分離、計數及IL-12、IL-13水平的檢測;采取眼球血進行血清IgE的水平的測定;取出右上葉肺組織進行TLR7 mRNA表達水平的檢測。
　　 4.統(tǒng)計學分析
　　 使用SPSS11.5統(tǒng)計軟件對各組數據

9、進行統(tǒng)計學分析,用均數士標準差(-x±s)的形式來表示,3組小鼠問的數據比較采用單因素方差分析,數掘間的兩兩比較用LSD-t檢驗,P＜0.05表明差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：
　　 1.病理結果
　　 光鏡下,正常組小鼠支氣管管壁無增厚,無異常的分泌物,氣管粘膜下及肺泡腔內無炎性滲出物及炎癥細胞滲出。哮喘組小鼠細支氣管的管壁平滑肌增生增厚,支氣管分泌物增加,纖毛上皮細胞脫落,排列紊亂,周圍組織水腫,微血管通透

10、性增加,血管和支氣管周圍組織見較多炎性細胞浸潤,以嗜酸性粒細胞和淋巴細胞為主。與哮喘組相比,咪喹莫特組小鼠的炎性細胞及炎性滲出物等均有所減少。
　　 2.肺泡灌洗液中細胞計數與分類在肺泡灌洗液中,哮喘組小鼠的細胞總數及嗜酸性粒細胞、淋巴細胞與正常組比較明顯增加,而咪喹莫特治療組小鼠較哮喘組有所減輕(P＜0.05)。
　　 3.各組小鼠肺泡灌沈液中IL-12、IL-13和血清中IgE水平在肺泡灌沈液中,哮喘組小鼠IL-12

11、水平較正常組減少,咪喹莫特組IL-12高于哮喘組但低于正常組(P＜0.05);哮喘組小鼠中的IL-13水平較正常組升高,咪喹莫特組IL-13與哮喘組比較降低(P＜0.05),但較正常組升高;哮喘組小鼠血清中的IgE水平較正常組顯著升高,而咪喹莫特組中的IgE水平明顯低于哮喘組,但高于正常組;IL-12與IgE呈負相關(r=-0.802),而IL-13與IgE呈正相關(r=0.774)。
　　 4.各組小鼠肺TLR7 mRNA基因

12、的表達哮喘組小鼠肺組織TLR7 mRNA基因的表達低于正常組,咪喹莫特組小鼠肺組織TLR7 mRNA基因的表達明顯高于哮喘組和正常組(P＜0.05)。
　　 結論：
　　 1.霧化吸入咪喹莫特能上調Th1細胞因子IL-12水平且IL-12與血清IgE水平呈負相關,還能下調Th2細胞因子IL-13水平且IL-13與IgE水平呈正相關,使免疫反應偏向Th1型,從而減輕氣道炎癥反應與及高反應性;
　　 2.霧化吸入咪喹