基于帕金森病小鼠模型的中型多棘神經(jīng)元功能異常的研究.pdf

1、帕金森病(Parkinson's disease PD)是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，65歲以上老年人的發(fā)病率為1.7％，其中每10萬人中每年新增約17例PD患者。帕金森病的主要臨床癥狀表現(xiàn)為靜止性震顫、肌肉僵直、行動遲緩和運(yùn)動不能等，并常常伴有認(rèn)知障礙、精神癥狀及其它行為學(xué)改變。隨著我國社會逐漸進(jìn)入人口老齡化社會，該病的患病率存在上升趨勢，為家庭和社會帶來沉重的精神及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，因此對該病的研究也越來越受到人們的關(guān)注。
　　 基底

2、神經(jīng)節(jié)是控制和調(diào)節(jié)運(yùn)動功能的重要神經(jīng)元回路，帕金森病的運(yùn)動功能障礙與基底神經(jīng)節(jié)的運(yùn)動調(diào)節(jié)功能異常密切相關(guān)，紋狀體是基底神經(jīng)節(jié)的最大輸入核團(tuán)，其對維持基底神經(jīng)節(jié)環(huán)路:直接通路（紋狀體-蒼白球內(nèi)側(cè)部-黑質(zhì)網(wǎng)狀部）和間接通路（紋狀體-蒼白球外側(cè)部-丘腦底核-蒼白球內(nèi)側(cè)部-黑質(zhì)網(wǎng)狀部）的平衡起到非常重要的作用。紋狀體內(nèi)最主要的細(xì)胞類型為中型多棘神經(jīng)元，其上游主要接收來自皮層和丘腦的興奮性傳入，信息在紋狀體經(jīng)過處理后，通過下游的直接和間接通路傳遞

3、給運(yùn)動皮層執(zhí)行具體運(yùn)動，然而，這種信息在紋狀體的處理是在黑質(zhì)-紋狀體多巴胺投射系統(tǒng)的多重調(diào)節(jié)之下進(jìn)行的，調(diào)節(jié)后的結(jié)果是易化強(qiáng)烈信息和抑制隨意信息。在帕金森病的病理狀態(tài)下，黑質(zhì)的多巴胺能神經(jīng)元發(fā)生退行性病變引起投射至紋狀體的多巴胺遞質(zhì)水平嚴(yán)重下降，因而信息在紋狀體的處理失去多巴胺的調(diào)節(jié)，以致傳遞到下游直接通路和間接通路的信息發(fā)生紊亂，最后導(dǎo)致運(yùn)動功能障礙。以往對與帕金森病的研究多集中在丘腦底核和輸出核蒼白球上，研究結(jié)果也顯示這些核團(tuán)神經(jīng)元

4、電生理活動發(fā)生了一定的改變，但是在此狀態(tài)下對紋狀體中型多棘神經(jīng)元的電生理活動變化的研究較少涉及，此外，在給予左旋多巴藥物治療帕金森病的過程中會出現(xiàn)左旋多巴誘導(dǎo)的一系列運(yùn)動功能障礙并發(fā)癥，這些并發(fā)癥的分子機(jī)制在紋狀體中型多棘神經(jīng)元上是如何體現(xiàn)的，目前也沒有很全面的相關(guān)報(bào)道，因此研究該區(qū)域的功能變化將有助于人們更深入全面地理解帕金森病的病理過程以及各種并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制。
　　 本研究著眼于紋狀體中型多棘神經(jīng)元，首先檢測中型多棘神經(jīng)元

5、上多巴胺D1和D2受體表達(dá)水平的變化，然后研究中型多棘神經(jīng)元由于缺失多巴胺發(fā)生的代償性變化，最后探測定位于中型多棘神經(jīng)元突觸前膜和胞體上多巴胺受體的功能變化。本研究使用的動物模型是基因敲除導(dǎo)致紋狀體嚴(yán)重缺乏多巴胺遞質(zhì)的小鼠和轉(zhuǎn)基因構(gòu)建綠色熒光蛋白標(biāo)記紋狀體D2中型多棘神經(jīng)元的小鼠，通過將兩種小鼠雜交后，獲得具備兩種特性的PitxHomo/D2GFP小鼠，這樣就能在基因敲除導(dǎo)致多巴胺嚴(yán)重缺失的狀態(tài)下特異地區(qū)分及研究D1和D2中型多棘神經(jīng)元

6、。首先采用分子生物學(xué)半定量和熒光定量PCR的方法，在紋狀體內(nèi)分區(qū)域取樣本，檢測在多巴胺遞質(zhì)缺失的狀態(tài)下，紋狀體內(nèi)多巴胺D1和D2受體在不同區(qū)域表達(dá)量的變化;然后通過電生理學(xué)膜片鉗方法，及后期腹腔注射給予左旋多巴藥物治療，探討多巴胺缺失引起的紋狀體D1中型多棘神經(jīng)元興奮性發(fā)生的代償性變化;最后以與水平方向成30度斜角橫切腦片的方法保留完整的突觸聯(lián)系，通過電生理膜片鉗方法，在給予外源時(shí)多巴胺時(shí)，研究紋狀體中型多棘神經(jīng)元由于突觸前及胞體上的多

7、巴胺受體反應(yīng)性增強(qiáng)發(fā)生的功能性變化。結(jié)果如下:
　　 1.半定量PCR檢測結(jié)果顯示紋狀體背側(cè)區(qū)域內(nèi)PitxHomo D1和D2受體相對灰度值與PitxWT D1和D2受體的相對灰度值相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05，P＞0.05);腹側(cè)區(qū)域內(nèi)PitxHomo與PitxWT的D1和D2受體的相對灰度值也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05，P＞0.05）。為了確認(rèn)此結(jié)果我們使用熒光定量PCR方法檢測，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與半定量PCR結(jié)果相類似，顯

8、示PitxHomo和PitxWT兩組動物的背側(cè)和腹側(cè)兩個(gè)區(qū)域的D1和D2受體的表達(dá)量無顯著性差異(P＞0.05，P＞0.05, P＞0.05 P＞0.05)。
　　 2.在電生理學(xué)上，神經(jīng)元膜的輸入電阻(input resistence RIn)是反映了神經(jīng)元內(nèi)在的興奮性的關(guān)鍵參數(shù)。在電流鉗模式下，通過對D1中型多棘神經(jīng)元注入一系列階躍方波電流，獲取相應(yīng)的膜電位值，作電流-電壓曲線比較PitxHomo和PitxWT兩種動物D1中

9、型多棘神經(jīng)元的RIn，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示相同的電流值在PitxHomo D1中型多棘神經(jīng)元上產(chǎn)生的膜電位值比在PitxWT D1中型多棘神經(jīng)元上產(chǎn)生的要大(P＜0.05)，根據(jù)歐姆定律U=IR，可得知PitxHomo D1中型多棘神經(jīng)元的RIn增加，興奮性增強(qiáng)。由于不同的年齡的小鼠神經(jīng)元的RIn也會有所變化，為了排除年齡因素的干擾，將小鼠分成三個(gè)年齡組(14-16days，17-19days，20-23days)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在不同的

10、年齡組中，PitxHomo D1中型多棘神經(jīng)元與PitxWT D1中型多棘神經(jīng)元相比，具有較大的RIn(P＜0.05，P＜0.05，P＜0.05)。為了判斷是何種因素變化引起PitxHomo D1中型多棘神經(jīng)元的RIn的增加，通過使用含鉀離子通道抑制劑氯化銫的電極內(nèi)液記錄細(xì)胞，結(jié)果顯示由于沒有電壓依賴性通道的影響，電流-電壓曲線變?yōu)榫€性，但PitxHomo D1中型多棘神經(jīng)元與PitxWT D1中型多棘神經(jīng)元的RIn的差別仍然存在(P＜

11、0.05)，提示有可能是膜表面面積減少引起PitxHomo D1中型多棘神經(jīng)元RIn的增加，在接下來的研究工作中我們會通過進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)去確證這種可能性。為了驗(yàn)證PitxHomo D1中型多棘神經(jīng)元RIn的增加與多巴胺缺失的關(guān)系，分別給予同窩出生的兩組PitxHomo小鼠左旋多巴藥物和生理鹽水腹腔注射，結(jié)果顯示左旋多巴藥物治療組小鼠D1中型多棘神經(jīng)元RIn有所降低(P＜0.05)。在電流鉗模式下，注入電流使D1中型多棘神經(jīng)元產(chǎn)生動作電位，

12、比較能觸發(fā)PitxHomo D1中型多棘神經(jīng)元與PRxWT D1中型多棘神經(jīng)元產(chǎn)生動作電位的電流值，結(jié)果顯示PitxHomo D1中型多棘神經(jīng)元產(chǎn)生動作電位所需的電流值降低(P＜0.05)。電壓鉗模式下，調(diào)整刺激器刺激強(qiáng)度使PitxHomo和PitxWT的D1中型多棘神經(jīng)元產(chǎn)生幅度一致的興奮性突觸后電流EPSC，然后切換至電流鉗模式比較D1中型多棘神經(jīng)元產(chǎn)生的興奮性突觸后電壓EPSP的幅度面積，結(jié)果顯示PitxHomo D1中型多棘神經(jīng)

13、元產(chǎn)生的EPSP的面積變大（P＜0.05）。
　　 3.在電流鉗模式下，注入電流使D1中型多棘神經(jīng)元產(chǎn)生動作電位，然后水浴給予外源性多巴胺，觀察動作電位數(shù)目的變化，結(jié)果顯示與PitxWT相比，多巴胺引起PitxHomo D1中型多棘神經(jīng)元動作電位增加的數(shù)目變大(P＜0.05)。在接下來的研究工作中，我們會進(jìn)一步確認(rèn)是何種離子通道活性的改變導(dǎo)致多巴胺引起PitxHomo D1中型多棘神經(jīng)元膜電位的變化比PitxWT D1中型多棘神

14、經(jīng)元膜電位的變化要大。
　　 4.以與水平方向成30度斜角橫切腦片的方法保留完整的皮層-紋狀體和丘腦-紋狀體的突觸聯(lián)系，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的皮層-紋狀體和丘腦-紋狀體突觸反應(yīng)的特征，比較實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果，結(jié)果顯示以雙脈沖刺激比值PPR作為觀察值時(shí)，刺激皮層誘發(fā)D1中型多棘神經(jīng)元和D2中型多棘神經(jīng)元產(chǎn)生的PPR＞1，兩者無顯著性差異(P＞0.05);刺激丘腦誘發(fā)D1中型多棘神經(jīng)元和D2中型多棘神經(jīng)元產(chǎn)生的PPR＜1，兩者無顯著性差異(P＞0

15、.05);PitxHomo和PitxWT小鼠比較，兩組動物也無顯著性差異（P＞0.05）;然而皮層刺激和丘腦刺激相比較，兩者有顯著性差異（P＜0.05）;以上結(jié)果均與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相符合，保證了后續(xù)實(shí)驗(yàn)在穩(wěn)定可重復(fù)的條件下進(jìn)行。在電壓鉗模式下，通過刺激皮層，記錄紋狀體D1和D2中型多棘神經(jīng)元產(chǎn)生的興奮性突觸后電流EPSC，然后水浴給予外源性多巴胺，觀察EPSC幅度的變化，結(jié)果顯示以產(chǎn)生的第一個(gè)EPSC的幅值作為觀察值時(shí)，與PitxWT相比

16、，多巴胺抑制PitxHomo D1和D2中型多棘神經(jīng)元產(chǎn)生的EPSC的作用增加(P＜0.05，P＜0.05)，但是多巴胺對D1和D2中型多棘神經(jīng)元的抑制作用相比較，兩者無顯著性差異（P＞0.05）。通過刺激丘腦，記錄紋狀體D1和D2中型多棘神經(jīng)元產(chǎn)生的興奮性突觸后電流EPSC，然后水浴給予外源性多巴胺，觀察EPSC幅度的變化，結(jié)果顯示以產(chǎn)生的第一個(gè)EPSC的幅值作為觀察值時(shí)，與PitxWT相比，多巴胺抑制PitxHomo D1和D2中型

17、多棘神經(jīng)元產(chǎn)生的EPSC的作用增加(P＜0.05，P＜0.05)，但是多巴胺對D1和D2中型多棘神經(jīng)元的抑制作用相比較，兩者無顯著性差異(P＞0.05)。比較不同刺激區(qū)域的結(jié)果，刺激丘腦時(shí)多巴胺對D1和D2中型多棘神經(jīng)元的抑制作用明顯大于刺激皮層時(shí)多巴胺對D1和D2中型多棘神經(jīng)元的抑制作用（P＜0.05，P＜0.05）。當(dāng)反應(yīng)發(fā)生在突觸前時(shí)EPSC的PPR會發(fā)生改變，比較多巴胺給藥前和給藥后在D1和D2中型多棘神經(jīng)元記錄的PPR，結(jié)果顯

18、示皮層刺激時(shí)多巴胺引起D1和D2中型多棘神經(jīng)元的PPR增加(P＜0.05，P＜0.05)，丘腦刺激時(shí)多巴胺引起D1和D2中型多棘神經(jīng)元的PPR也增加(P＜0.05，P＜0.05)。為了判斷是哪種多巴胺受體介導(dǎo)多巴胺的抑制作用，刺激皮層和丘腦，水浴給予D2受體激動劑Ropinirole，結(jié)果顯示與多巴胺對D1及D2中型多棘神經(jīng)元的抑制作用相比，皮層刺激時(shí)Ropinirole對D1及D2中型多棘神經(jīng)元的抑制作用無顯著性差異（P＞0.05，P

19、＞0.05），丘腦刺激時(shí)Ropinirole對D1及D2中型多棘神經(jīng)元的抑制作用也無顯著性差異（P＞0.05，P＞0.05），但丘腦刺激時(shí)Ropinirole對D1和D2中型多棘神經(jīng)元的抑制作用明顯大于皮層刺激時(shí)Ropinirole對D1和D2中型多棘神經(jīng)元的抑制作用(P＜0.05，P＜0.05)。比較Ropinirole給藥前和給藥后在D1和D2中型多棘神經(jīng)元記錄的PPR，結(jié)果顯示皮層刺激時(shí)多巴胺引起D1和D2中型多棘神經(jīng)元的PPR增

20、加(P＜0.05，P＜0.05)，丘腦刺激時(shí)多巴胺引起D1和D2中型多棘神經(jīng)元的PPR也增加(P＜0.05，P＜0.05)。在電壓鉗模式下，刺激丘腦，記錄紋狀體D1和D2中型多棘神經(jīng)元產(chǎn)生的興奮性突觸后電位EPSP，然后水浴給予外源性多巴胺，觀察EPSP幅度的變化，結(jié)果顯示以產(chǎn)生的第一個(gè)EPSP的幅值作為觀察值時(shí)，與PitxWT相比，多巴胺抑制PitxHomo D1和D2中型多棘神經(jīng)元產(chǎn)生的EPSP的作用增加（P＜0.05，P＜0.05

21、），但是多巴胺對D1和D2中型多棘神經(jīng)元的抑制作用相比較，兩者無顯著性差異（P＞0.05）。
　　 通過以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究可得出如下結(jié)論:
　　 1.多巴胺缺失狀態(tài)下，紋狀體的多巴胺D1和D2受體的mRNA表達(dá)量沒有發(fā)生很明顯的上調(diào)。
　　 2.多巴胺的缺失使D1中型多棘神經(jīng)元本身失去活化的條件，這種活化在正常情況下是由于多巴胺配體結(jié)合其D1受體引起的。為了代償這一改變，D1中型多棘神經(jīng)元發(fā)生了適應(yīng)性變化，比如

22、通過減少神經(jīng)元的膜表面面積來增加其膜的輸入電阻RIn，使其對去極化刺激的反應(yīng)性增強(qiáng)，興奮性增加。
　　 3.多巴胺的缺失同時(shí)也導(dǎo)致D1中型多棘神經(jīng)元膜表面上的多巴胺D1受體功能增強(qiáng)，具體表現(xiàn)在與PitxWT相比同樣濃度的多巴胺能引起PitxHomo D1中型多棘神經(jīng)元放電增多。
　　 4.多巴胺缺失導(dǎo)致皮層-紋狀體和丘腦-紋狀體突觸前膜的多巴胺D2受體功能增強(qiáng)，具體表現(xiàn)在與PitxWT相比同樣濃度的多巴胺抑制PitxHo