原發(fā)性肝癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)密切相關(guān)microRNA的篩選及應(yīng)用.pdf

1、背景與目的:肝癌是目前世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，在全球惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率分別為第七位和第五位，我國(guó)衛(wèi)生部統(tǒng)計(jì)得出肝癌死亡率占腫瘤死亡率的第二位。肝癌分原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma HCC)、膽管細(xì)胞癌（cholangio carcinoma ICC）和混合細(xì)胞癌。其中肝細(xì)胞肝癌占90％以上。手術(shù)切除和肝臟移植是目前肝癌治療最有效的手段，但術(shù)后高復(fù)發(fā)率嚴(yán)重影響患者預(yù)后，有些患者即便行根治性肝

2、癌切除術(shù)后仍可能復(fù)發(fā)，這些和肝癌的生物學(xué)特性有關(guān)。大量文獻(xiàn)及既往臨床研究證實(shí):肝癌根治性切除術(shù)后第1年內(nèi)復(fù)發(fā)率最高，而且復(fù)發(fā)患者的預(yù)后也較其他惡性腫瘤晚期復(fù)發(fā)的患者差。因此肝癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)已經(jīng)成為影響患者預(yù)后的重要因素。從肝癌早期復(fù)發(fā)的生物學(xué)特性開始研究，找出影響肝癌發(fā)生的關(guān)鍵信號(hào)通路及靶基因，有利于更早預(yù)測(cè)診斷肝癌高危人群，并采取相應(yīng)地有效措施來(lái)提高肝癌根治性的可切除術(shù)率，確保手術(shù)療效。
　　 傳統(tǒng)的肝癌治療的方法有一定的滯后

3、性。因此，有必要結(jié)合引響肝癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程的多因素，運(yùn)用基因組群分析方法從分子水平上發(fā)現(xiàn)肝癌復(fù)發(fā)及侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制。找出與肝癌復(fù)發(fā)侵襲相關(guān)的敏感基因作為治療肝癌的分子靶標(biāo)，為臨床上根治肝癌帶來(lái)新的思路。
　　 MicroRNA是一類新發(fā)現(xiàn)的非編碼小分子RNA，是哺乳動(dòng)物基因組中最為豐富的調(diào)節(jié)基因之一，預(yù)測(cè)其可能調(diào)控著至少三分之一的人類編碼基因而miRNA本身并不編碼蛋白，它通過(guò)與特異的靶mRNA結(jié)合，降解或抑制其翻譯過(guò)程，從而降低相

4、應(yīng)靶基因的表達(dá)調(diào)控。到目前為止人類發(fā)現(xiàn)了1000多個(gè)miRNAs，其中已被證實(shí)的miRNA就達(dá)500多個(gè)。miRNA的具體如何調(diào)控調(diào)節(jié)靶蛋白的翻譯目前尚不清楚。隨著對(duì)miRNA功能研究的深入，越來(lái)越多的研究表明miRNA與人類疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，特別是在腫瘤的發(fā)生、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、侵襲中起到關(guān)鍵作用，目前已經(jīng)是腫瘤研究的熱點(diǎn)之一。
　　 近期的研究發(fā)現(xiàn)，不同類型的腫瘤有不同組合的miRNAs異常表達(dá)譜，提示腫瘤的miRNAs表達(dá)

5、具有其組織特異性。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)肝癌組織中miR-18、precursor miR-18、miR-224較正常組織有更高水平的表達(dá)，miR-199a、miR-195、miR-200a、miR-125a較正常組織有低水平表達(dá)。而在大鼠肝癌組織中，let-7a、miR-21、miR-23、miR-130、miR-190、miR-17-92都有表達(dá)水平的上調(diào)，但肝組織富集的miR-122在癌組織中表達(dá)水平明顯下調(diào)。上述異常表達(dá)的miRNA在功

6、能分析研究中顯示可能與肝癌細(xì)胞的分化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)。
　　 miRNA是完全天然的內(nèi)源性反義調(diào)節(jié)因子，基于miRNA的基因治療可能成為抑制腫瘤惡化的有效途徑。目前有關(guān)肝癌的研究報(bào)道主要集中于模擬內(nèi)源性miRNA，增強(qiáng)其對(duì)靶基因的作用效能;或以miRNA為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)小分子物質(zhì)拮抗miRNA的作用，如miRNA反義寡聚（脫氧）核苷酸(anti-miRNA oligonucleotides，AMOs)、鎖定核酸修飾的寡核苷酸(locke

7、d nucleic acid，LNA-modified oligonucleotides)以及miRNA拮抗分子(antagomis)等。而針對(duì)目標(biāo)基因設(shè)計(jì)靶向特異性miRNA作用于肝癌細(xì)胞方面的研究，國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。
　　 最近有數(shù)據(jù)表明某些特定作用的microRNA在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的過(guò)表達(dá)或缺失與臨床上不同亞型的腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與侵襲性功能密切相關(guān)。研究表明mir-144在許多腫瘤中表達(dá)失控。如乳腺癌、白血病、肝癌、少突角質(zhì)細(xì)胞

8、瘤等疾病中異常表達(dá)。另外，mir-144通過(guò)下調(diào)Rb1通路途徑發(fā)揮乳腺癌細(xì)胞的增殖效應(yīng)。眾多的數(shù)據(jù)表明mir-144在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因素。
　　 研究發(fā)現(xiàn)，miR-200c和miR-200b通過(guò)鋅指結(jié)構(gòu)的E-盒結(jié)合同源異型盒(zinc-finger E-box binding homeobox，ZEB)來(lái)上調(diào)E-cadherin表達(dá)抑制上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelial-mesenchchymal tr

9、ansition，EMT)。值得研究的是ZEB1和ZEB2也能與miR-200家族上游的啟動(dòng)子E-box或Z-box結(jié)合抑制miR-200家族的轉(zhuǎn)錄。提示:miR-200家族與靶基因ZEB之間互相通過(guò)負(fù)反饋調(diào)節(jié)二者之間的表達(dá)平衡。miRNA在腫瘤中有可能起促癌作用也有可能起抑癌作用，甚至在微環(huán)境條件變化下既起癌基因作用又起抑癌基因的作用。Let-7家族、miR-206、miR-335在乳腺癌中起抑癌作用;miR-378、miR-373、

10、miR-21、miR-10b等在乳腺癌中起促癌作用。目前有關(guān)與肝癌相關(guān)miRNA的研究很多，而與肝癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)相關(guān)。miRNA表達(dá)譜及miRNA在肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制尚不清楚。
　　 國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)mir-144在肝癌腫瘤中表達(dá)下調(diào)，其異常表達(dá)在多種腫瘤中得到證實(shí)。推測(cè)mir-144可能在肝癌中發(fā)揮抑癌基因的作用。為進(jìn)一步研究mir-144在肝癌中的作用，本研究通過(guò)microRNA基因芯片篩選出mir-144在肝癌中表達(dá)上調(diào)

11、，初步證實(shí)mir-144在肝癌中發(fā)揮促癌基因的作用。在以后的研究中將mir-144作為肝癌治療的靶點(diǎn)，為肝癌的分子分型及臨床診治提供新的思路。
　　 MicroRNA通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白來(lái)發(fā)揮促癌以及抑癌作用，有學(xué)者提出在正常細(xì)胞中生理濃度的microRNA抑制調(diào)節(jié)細(xì)胞周期靶蛋白的表達(dá)。當(dāng)microRNA表達(dá)過(guò)高就抑制細(xì)胞周期靶蛋白的調(diào)節(jié)，阻止細(xì)胞周期分化，細(xì)胞處于癌變低分化狀態(tài)。有關(guān)microRNA在肝癌中的研究報(bào)道[11]:

12、miR-195抑制其對(duì)應(yīng)的靶基因細(xì)胞周期蛋白CDK6和D1而抑制肝癌細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)化。而且miR-195通過(guò)抑制RB蛋白的磷酸化而阻止下游靶基因的活化。提示:miR-195在肝癌產(chǎn)生的分子機(jī)制方面以及細(xì)胞周期調(diào)節(jié)方面具有潛在的意義。
　　 由于腫瘤組織的特異性，使得miRNA引響到腫瘤的分子分型，并在臨床疾病診治方面顯得尤為重要。而隨著腫瘤相關(guān)miRNAs及其靶基因的發(fā)現(xiàn)以及分子機(jī)制的研究使得有些問(wèn)題值得研究者思考:在整個(gè)

13、基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中miRNA只是起間接調(diào)控作用，它并不是單一或某些特定基因的表達(dá)產(chǎn)物。一個(gè)miRNA可同時(shí)或同步調(diào)節(jié)多個(gè)靶基因的表達(dá)，如果只是改變單個(gè)miRNA可能會(huì)影響到其他未知的靶基因。相反，單一的靶基因也可能同時(shí)或同步被多個(gè)miRNA調(diào)控。單一的miRNA可能不足以影響到特定靶基因的表達(dá)。因此，目前把miRNA應(yīng)用于臨床診斷和治療還為時(shí)尚早，但對(duì)miRNA具體作用機(jī)制以及對(duì)靶基因的調(diào)控還需進(jìn)一步更加細(xì)致深入的研究。
　　 第一

14、部分microRNA芯片技術(shù)在肝癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)相關(guān)microRNA的篩選研究
　　 目的:利用microRNA芯片技術(shù)分析比較兩組不同復(fù)發(fā)傾向肝癌組織miRNA表達(dá)譜的差異，獲得與原發(fā)性肝癌早期復(fù)發(fā)密切相關(guān)的microRNAs
　　 方法:
　　 通過(guò)對(duì)行肝癌切除患者術(shù)前簽署知情同意書，收集2002年至2010年于我院接受肝癌根治性手術(shù)治療的原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者的手術(shù)標(biāo)本500余例。建立了一套數(shù)據(jù)完整肝癌標(biāo)本庫(kù)系統(tǒng)

15、，并制定完整的肝癌患者登記表且收集患者臨床各項(xiàng)病歷資料及隨訪資料。標(biāo)本收集好之后迅速轉(zhuǎn)至超低溫冰箱長(zhǎng)期凍存，把所收集的標(biāo)本及臨床資料統(tǒng)一編號(hào)，及時(shí)備案。現(xiàn)從我院肝癌數(shù)據(jù)標(biāo)本庫(kù)中挑選10例原發(fā)性肝癌深低溫凍存組織標(biāo)本。其中5例早期復(fù)發(fā)組（5例術(shù)后1年內(nèi)肝內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)病灶）;5例非早期復(fù)發(fā)組（5例術(shù)后超過(guò)2年未出現(xiàn)肝內(nèi)復(fù)發(fā)病灶）。首先采用分子生物學(xué)方法提取兩組肝癌組織總RNA并行CY3標(biāo)記;然后將所標(biāo)記后的RNA與Agilent公司的miRN

16、A芯片上進(jìn)行雜交反應(yīng);再利用SAM2.1軟件進(jìn)行分析篩選。采用Cluster3.0對(duì)差異表達(dá)的miRNA聚類分析。
　　 結(jié)果:本研究通過(guò)芯片實(shí)驗(yàn)共篩選獲得7個(gè)差異表達(dá)的microRNAs，其中4個(gè)表達(dá)上調(diào)，分別為mir-602、mir-451、mir-144、mir-486-5p表達(dá)上調(diào)。（其中mir-602上調(diào)2.29倍、mir-451上調(diào)3.73倍、mir-144上調(diào)5.28倍、mir-486-5p上調(diào)2.5倍，所用的P＜

17、0.05）;3個(gè)表達(dá)下調(diào)分別為mir-551b、mir-96、mir-502-3p表達(dá)下調(diào)。（其中mir-551b下調(diào)0.21倍、mir-96下調(diào)0.12倍、mir-502-3p下調(diào)0.042倍所有的P＜0.05）
　　 結(jié)論:利用microRNA基因芯片能快速、高通量的篩選出與原發(fā)性肝癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)密切相關(guān)的mircroRNA，該研究為基于肝癌相關(guān)microRNA的基因治療奠定了基礎(chǔ)。
　　 第二部分實(shí)時(shí)熒光定量PCR

18、技術(shù)(qRT-PCR)檢測(cè)mir-144、mir-502-3p在肝癌組織中相對(duì)表達(dá)水平
　　 目的:運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)在大樣品的基礎(chǔ)上驗(yàn)證miRNA基因芯片所預(yù)測(cè)mir-144、mir-502-3p在肝癌早期復(fù)發(fā)組與非早期復(fù)發(fā)組之間miRNA表達(dá)水平的差異。
　　 方法:從我院肝癌數(shù)據(jù)標(biāo)本庫(kù)中挑選82例原發(fā)性肝癌深低溫凍存組織標(biāo)本。其中50例早期復(fù)發(fā)組（50例術(shù)后1年內(nèi)肝內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)病灶）;32例非早期復(fù)發(fā)組（32例術(shù)

19、后超過(guò)2年未出現(xiàn)肝內(nèi)復(fù)發(fā)病灶）。利用分子生物學(xué)方法提取總RNA，以U6為內(nèi)參基因。分別合成mir-144、mir-503-3p和U6的特異性的引物，以SYBR Green染料法對(duì)mir-144、mir-502-3p、U6的特異性擴(kuò)增引物行qRT-PCR實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)。結(jié)果運(yùn)用ABIsds2.1軟件分析，繪制擴(kuò)增曲線、溶解曲線。計(jì)算比較早期復(fù)發(fā)組與非早期復(fù)發(fā)組兩組間mir-144、mir-502-3p在肝癌中表達(dá)的相對(duì)表達(dá)量的差異。

20、　　 結(jié)果:qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果與miRNA芯片篩選的結(jié)果一致。qRT-PCR結(jié)果顯示:mir-144、mir-502-3p兩基因引物的擴(kuò)增產(chǎn)物均為單峰。mir-144在早期復(fù)發(fā)組比非早期組上調(diào)6.944倍，mir-502-3p在早期復(fù)發(fā)組比非早期復(fù)發(fā)組下調(diào)0.253倍。兩組比較在統(tǒng)計(jì)學(xué)上均有顯著的差異。利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)miR-144靶基因可能為Rb1，miR-502-3p靶基因可能為SET。
　　 結(jié)論: mir-1