二氮嗪預(yù)處理對(duì)小鼠肝移植缺血—再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的： 一、研究二氮嗪預(yù)處理對(duì)肝細(xì)胞缺氧-復(fù)氧后Bcl-2蛋白表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響，探討二氮嗪對(duì)肝細(xì)胞缺氧-復(fù)氧損傷的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。 二、摸索小鼠肝移植動(dòng)物模型中應(yīng)用RNA干擾技術(shù)沉默Bcl-2基因表達(dá)的方法。 三、研究二氮嗪預(yù)處理對(duì)小鼠肝移植缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用及其與凋亡調(diào)控相關(guān)的可能機(jī)制。 方法： 1.建立小鼠肝細(xì)胞缺氧-復(fù)氧損傷模型，細(xì)胞隨機(jī)分為A組(缺氧-復(fù)氧損傷組)，B組(

2、二氮嗪預(yù)處理組)和C組(正常對(duì)照組)，分別于細(xì)胞缺氧-復(fù)氧損傷后6h、12h、24h、48h、72h5個(gè)時(shí)相點(diǎn)采集標(biāo)本，檢測(cè)肝細(xì)胞缺氧-復(fù)氧后細(xì)胞培養(yǎng)液中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)濃度，肝細(xì)胞Bcl-2mRNA和蛋白表達(dá)及肝細(xì)胞凋亡率變化。 2.建立小鼠同種異體原位肝移植模型，根據(jù)冷保存的時(shí)間隨機(jī)分為A組(冷保存4h組)，B組(冷保存8h組)，C組(冷保存12h組)，通過(guò)各組小鼠移植術(shù)后14d存活情況做生存曲線分

3、析；建立小鼠肝移植RNA干擾模型，利用化學(xué)合成Bcl-2基因的SiRNA，經(jīng)門(mén)靜脈高壓注射途徑導(dǎo)入供體肝臟。動(dòng)物分為D組(供肝導(dǎo)入Bcl-2SiRNA組)，E組(供肝導(dǎo)入Bcl-2SiRNA6h肝臟移植組)，F(xiàn)組(供肝導(dǎo)入Bcl-2SiRNA24h肝臟移植組)和G組(正常對(duì)照組)。D組、E組、F組內(nèi)分別設(shè)導(dǎo)入non-sencesiRNA組為陰性對(duì)照。D組于SiRNA導(dǎo)入后6h、24h、48h、72h4個(gè)時(shí)相點(diǎn)采集標(biāo)本，E組、F組和G組于

4、移植術(shù)后24h采集標(biāo)本，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測(cè)：Bcl-2mRNA表達(dá)變化。 3.供肝導(dǎo)入Bcl-2SiRNA24h摘取供肝建立小鼠肝移植RNA干擾模型，動(dòng)物分為A組(冷保存2h肝移植組)、B組(供肝導(dǎo)入：Bcl-2SiRNA24h冷保存2h移植組)、C組(二氮嗪預(yù)處理冷保存2h肝移植組)、D組(供肝導(dǎo)入Bcl-2SiRNA24h二氮嗪預(yù)處理冷保存2h肝移植組)和E組(供肝導(dǎo)入non-senceSiRNA24h冷保存2

5、h移植組)。每組小鼠6只，移植術(shù)后24h采集標(biāo)本，檢測(cè)肝移植術(shù)后肝細(xì)胞病理形態(tài)學(xué)改變、血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)濃度，肝組織Bcl-2mRNA和蛋白表達(dá)及肝細(xì)胞凋亡率變化。 結(jié)果： 1.在小鼠肝細(xì)胞缺氧-復(fù)氧損傷模型中，A、B組細(xì)胞培養(yǎng)液中ALT、AST濃度與C組比較明顯升高(P＜0.01)，A、B兩組之間比較，細(xì)胞培養(yǎng)液中ALT、AsT濃度在缺氧-復(fù)氧6h差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，12h、

6、24h、48h和72hB組ALT、AST濃度明顯低于A組(P＜0.01)。A、B組肝細(xì)胞凋亡率均高于C組(P＜0.01)，A、B兩組之間比較，肝細(xì)胞凋亡率在缺氧-復(fù)氧6h差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，12h、24h、48h和72hB組肝細(xì)胞凋亡率明顯低于A組(P＜0.01)。肝細(xì)胞Bcl-2mRNA和蛋白表達(dá)，A組和C組中均較低，兩組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，B組中Bcl-2mRNA和蛋白表達(dá)明顯高于A、C組，缺氧-

7、復(fù)氧損傷6h、12h、24h、48h和72hB組與A組比較差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。 2.在小鼠肝移植模型中，A組術(shù)后生存率明顯高于B組和C組。在小鼠肝移植RNA干擾模型中，D組：Bcl-2mRNA表達(dá)量在6h開(kāi)始明顯下降，24h達(dá)到高峰，持續(xù)到72h，6h、24h、48h和72h.Bcl-2mRNA表達(dá)較正常對(duì)照組分別減少36.0％、66.2％、61.8％、58.1％。E組小鼠肝臟組織中Bcl-2:mRNA表達(dá)較G組

8、減少33.3％，F(xiàn)組較G組減少58.9％，F(xiàn)組與E組兩組之間比較，F(xiàn)組肝臟組織中Bcl-2mRNA表達(dá)較E組減少38.1％，兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 3.在二氮嗪預(yù)處理小鼠肝移植實(shí)驗(yàn)中，C組Bcl-2mRNA和蛋白表達(dá)水平較A組明顯增高(P＜0.01)，Bcl-2mRNA和蛋白表達(dá)分別增加2.6倍和5.1倍；B組Bcl-2mRNA和蛋白表達(dá)水平較A組明顯降低(P＜0.01)，：Bcl-2mRNA和蛋白表達(dá)分別被

9、抑制57.1％和83.4％；D組Bcl-2mRNA和蛋白表達(dá)水平較A組明顯降低(P＜0.01)，Bcl-2mRNA和蛋白表達(dá)分別減少53.3％和67.6％；B組與D組兩組之間比較Bcl-2mRNA和蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。C組中肝細(xì)胞病理?yè)p傷程度、凋亡指數(shù)、血清AST、ALT含量明顯低于各組。B組和D組中肝細(xì)胞病理?yè)p傷程度、凋亡指數(shù)、血清AST、ALT含量明顯高于各組。在各組中Bcl-2表達(dá)量與缺血再灌注損傷程度和