Daam1在肺癌中表達的研究.pdf

1、目的: Daam1是蓬亂蛋白相關形態(tài)形成活化因子1或稱形態(tài)發(fā)生紊亂關聯(lián)激活因子1，為形成素蛋白家族的成員。Daam1是WNT/PCP通路的組成因子之一，此通路參與原腸胚形成以及細胞骨架重排等生理過程，在胚胎癌細胞系F9中，Kristi LaMonica等人觀察了壁層內胚層的遷移并證明了PCP通路通過Rho/ROCK調控內胚層細胞的遷移。抑制PCP通路中的Daam1的表達不但能夠引起遷移細胞數(shù)量增加，也能導致細胞定向障礙。有活性的

2、的Daam1能夠抑制細胞的定向障礙。目前，關于Daam1在肺癌組織中的表達與腫瘤的惡性程度，組織學分型及侵襲轉移能力之間的關系均不清楚。本研究通過檢測肺腺癌、肺鱗癌及癌旁組織中的的Daaml的表達情況，分析其與臨床病理因素的關系，探討Daam1在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。并通過檢測不同侵襲能力肺癌細胞系的Daam1表達水平，研究它們與組織學分型的關系，進一步驗證Daam1在肺癌中的表達及與肺癌組織學類型的關系。 材料與方法:

3、 1、Western Blot 39例新鮮肺癌及相應癌旁組織標本，均取自中國醫(yī)科大學附屬醫(yī)院2007年—2008年間行外科手術切除的肺癌患者標本。人肺巨細胞癌細胞系BE1(高侵襲能力亞型)、LH7(低侵襲能力亞型)、人肺腺癌細胞系A549，人肺腺癌細胞系SPC、人肺腺癌細胞系LTE及人支氣管上皮細胞系HBE，為本實驗室凍存。提取組織與細胞的蛋白，采用考馬斯亮藍法進行蛋白定量。取等量蛋白，進行SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳和轉印，一抗

4、(anti—Daam11：200稀釋，anti-β—actin1：500稀釋)和辣根過氧化物酶標記二抗(1：2000稀釋)孵育，ECL發(fā)光。以β—actin為內對照，結果判定為PVDF膜上出現(xiàn)灰色條帶，并對條帶進行灰度值測定。 2. RT-PCR 37例新鮮肺鱗癌，腺癌，及相應癌旁組織取自中國醫(yī)科大學附屬醫(yī)院2007年—2008年間手術切除的標本。人肺巨細胞癌細胞系BE1(高侵襲能力亞型)、LH7(低侵襲能力亞型)、人肺

5、腺癌細胞系A549，人肺腺癌細胞系SPC、人肺腺癌細胞系LTE及人支氣管上皮細胞系HBE，為本實驗室凍存。提取組織與細胞的mRNA，用紫外分光光度計測定RNA的濃度，并用RNAnase free H20將RNA濃度稀釋成500ng/ul后，逆轉錄獲得cDNA，測量并調節(jié)cDNA濃度，進行PCR，PCR擴增產物經(jīng)溴化乙啶(EB)染色，凝膠成像系統(tǒng)(BioImageing System，UVP，CA)下觀察。以β—actin為內對照，計算D

6、aam1的相對平均表達量。 3、統(tǒng)計分析 應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，P<0.05為有統(tǒng)計學意義。 結果: 1、Daam1在肺癌和癌旁肺組織中的表達 對39例新鮮肺鱗癌、腺癌和癌旁組織進行Western Blot分析，結果顯示：Daam1在肺鱗癌、腺癌和癌旁正常肺組織中均有表達，分子量約為123kDa，但在癌組織中的表達明顯高于癌旁組織(P<0.01)。 對37例新鮮肺鱗癌、腺癌

7、和癌旁組織進行RT-PCR分析，結果顯示：Daam1在肺鱗、腺癌和癌旁正常肺組織中均表達，分子量為235kDa，但在癌組織中的表達明顯高于癌旁組織。(P=0.032)。 2、Daam1蛋白在肺癌細胞系和人支氣管上皮細胞系中的表達 Daam1蛋白在5種肺癌細胞系及人支氣管上皮細胞系中均表達，但在肺癌細胞系中Daam1的蛋白表達量高于正常人支氣管上皮細胞，肺巨細胞癌細胞系BE1、LH7、人肺腺癌細胞系LTE的Daam1蛋白表

8、達量明顯高于人肺腺癌細胞系A549，人肺腺癌細胞系SPC、及人支氣管上皮細胞系HBE。經(jīng)兩兩比較，BE1、LH7、LTE和HBE之間表達Daam1蛋白的差異均具有統(tǒng)計學意義。 3、Daam1 mRNA在肺癌細胞系和人支氣管上皮細胞系中的表達 Daam1mRNA在5種肺癌細胞系及人支氣管上皮細胞系中均表達，但在肺癌細胞系中Daam1mRNA的表達量高于正常人支氣管上皮細胞，以肺巨細胞癌細胞系低侵襲能力亞型LH7 Daam1

9、 mRNA表達量最高，其次依次為肺巨細胞癌細胞系高侵襲能力亞型BE1、人肺腺癌細胞系LTE、人肺腺癌細胞系SPC、最后為腺癌細胞系A549和人支氣管上皮細胞系HBE。除人肺腺癌細胞系A549與人支氣管上皮細胞系HBE表達Daam1 mRNA的差異無統(tǒng)計意義(P=0.299)以外，經(jīng)兩兩比較，各肺癌細胞系與HBE、以及各種肺癌細胞系之間表達Daam1 mRNA的差異均具有統(tǒng)計學意義。 然后，又采用了倍比稀釋的方法進一步驗證了Daa

10、m1 mRNA在各種細胞系中的表達情況。并對肺癌細胞系及人支氣管上皮細胞系中表達的Daam1 mRNA、蛋白進行了Pearson相關分析，統(tǒng)計結果顯示Daam1 mRNA、蛋白在這六種細胞系中的表達具有相關性(r=0.778，p<0.01)。 結論: 1、Daam1 mRNA、蛋白在肺癌組織中的表達高于癌旁肺組織。 2、Daam1 mRNA、蛋白在肺癌細胞系中的表達高于支氣管上皮細胞。 3、Daam1mR