攜人胰島素樣生長因子-1基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其在離體成肌細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、骨骼肌損傷在運(yùn)動醫(yī)學(xué)領(lǐng)域十分常見,是較難處理的運(yùn)動損傷.骨骼肌損傷后再生能力有限,自然愈合質(zhì)量不可靠,易發(fā)生再次損傷,嚴(yán)重影響了肌肉運(yùn)動功能.研究發(fā)現(xiàn)胰島素樣生長因子1(Insulin-like growth factor-1,IGF-1)能有效促進(jìn)成肌細(xì)胞的增殖及分化形成肌管,同時增強(qiáng)再生肌肉的收縮力.但局部直接注射IGF-1效應(yīng)往往短暫,效果并不理想.隨著基因治療技術(shù)的發(fā)展,使得骨骼肌損傷的生長因子基因治療成為可能.可將生長因子基因

2、導(dǎo)入成肌細(xì)胞,然后植入骨骼肌損傷區(qū),通過該基因在體內(nèi)的持續(xù)表達(dá),誘導(dǎo)體內(nèi)成肌細(xì)胞分化為肌細(xì)胞并融合為肌管,進(jìn)而促進(jìn)肌肉愈合.該實(shí)驗(yàn)第一部分構(gòu)建了攜人胰島素樣生長因子1(human Insulin-like growthfactor-1,hIGF-1)基因的真核表達(dá)質(zhì)粒并體外轉(zhuǎn)染成肌細(xì)胞.將hIGF-1基因與pcDNA3.1質(zhì)粒重組為真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-hIGF-1,經(jīng)酶切及測序鑒定hIGF-1基因片段插入方向正確;采用脂質(zhì)體介

3、導(dǎo)法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成肌細(xì)胞株C2C12細(xì)胞,經(jīng)G418篩選培養(yǎng)4周,獲得陽性細(xì)胞克隆,并轉(zhuǎn)染了綠色熒光蛋白pEGFP-N3質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)染效率.該實(shí)驗(yàn)第二部分對轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的C2C12細(xì)胞進(jìn)行了hIGF-1表達(dá)的鑒定并檢測表達(dá)產(chǎn)物的生物活性.分別從mRNA水平和蛋白水平用RT-PCR方法和免疫細(xì)胞化學(xué)方法證實(shí)hIGF-1在C2C12細(xì)胞中獲得了穩(wěn)定表達(dá);采用MTT法檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的培養(yǎng)上清對BALB/c 3T3細(xì)胞的促增殖作用,證實(shí)細(xì)胞表達(dá)