p38MAPK與脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的關(guān)系及參與慢性前列腺炎疼痛的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景：慢性前列腺炎(chronic prostatitis，CP)是泌尿外科最常見(jiàn)疾病之一，該病病因、病理改變、臨床癥狀復(fù)雜多樣，其中疼痛是慢性前列腺炎患者最主要的癥狀。盡管前列腺炎一般不會(huì)對(duì)生命造成威脅，但可嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，尤其是對(duì)患者精神健康的影響比嚴(yán)重的糖尿病和慢性心力衰竭更為明顯。由于慢性前列腺炎病因復(fù)雜，治療困難，雖已有大量的基礎(chǔ)和臨床研究，但至今尚無(wú)突破性進(jìn)展。因此，從疼痛機(jī)理研究入手，有望開(kāi)創(chuàng)新的慢性前列腺炎治療方法

2、。由于前列腺疼痛呈現(xiàn)內(nèi)臟牽涉痛特點(diǎn)，目前認(rèn)為前列腺疼痛的持續(xù)與泛化與支配前列腺的L5～S2脊髓段的繼發(fā)性病變有關(guān)。 在慢性前列腺炎L5～S2脊髓段的繼發(fā)性病變研究中，發(fā)現(xiàn)除神經(jīng)元外，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞具有較大作用。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)系統(tǒng)中除神經(jīng)元以外的第二大類細(xì)胞，廣泛分布于腦和脊髓。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，痛覺(jué)的傳導(dǎo)和調(diào)制不僅僅是神經(jīng)元的功能，活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞也通過(guò)和神經(jīng)細(xì)胞的相互作用及炎性因子的分泌而參與病理性疼痛的發(fā)生。星形膠質(zhì)細(xì)胞功能受

3、許多神經(jīng)體液因子的調(diào)節(jié)，目前引起廣泛重視的有p物質(zhì)(substance P，SP)、谷氨酸和各種炎性因子等，周圍慢性疼痛可通過(guò)這些遞質(zhì)和生物因子的作用影響脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞功能，從而參與慢性疼痛在脊髓初級(jí)中樞的傳導(dǎo)和調(diào)制。SP不僅作為神經(jīng)遞質(zhì)向中樞傳遞來(lái)自外界的物理、化學(xué)和溫度等傷害性刺激，具有導(dǎo)致疼痛的作用，同時(shí)還可在接受刺激信號(hào)后由神經(jīng)末梢在局部釋放出來(lái)，參與損傷局部的免疫、炎癥反應(yīng)及損傷的修復(fù)。 L5～S2脊髓段神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)

4、胞參與前列腺疼痛調(diào)節(jié)的可能機(jī)制研究中，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究尤其重要。p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK)屬于哺乳動(dòng)物應(yīng)激與炎癥激活的絲裂原活化蛋白激酶家族重要成員。p38MAPK信號(hào)通路參與了細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育及細(xì)胞間功能同步等多種生理過(guò)程，并與炎癥、應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控密切相關(guān)，被認(rèn)為是細(xì)胞信息傳遞的交匯點(diǎn)和共同通路。脊髓cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP respo

5、nseelement binding protein，CREB)轉(zhuǎn)錄因子屬于堿性氨基酸亮氨酸拉鏈(bZIP)轉(zhuǎn)錄因子家族，參與多種生物分子基因表達(dá)的調(diào)控。核轉(zhuǎn)錄因子kB(Nuclear factor-kappa b，NF-kB)是能調(diào)節(jié)多種炎癥和免疫基因表達(dá)的一種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。有證據(jù)表明，這些因子在疼痛機(jī)制中發(fā)揮一定的作用，研究這些因子的生物學(xué)特性及其在慢性前列腺疼痛脊髓膠質(zhì)細(xì)胞活化中的調(diào)節(jié)機(jī)理，有助于進(jìn)一步了解慢性前列腺疼痛的發(fā)

6、病機(jī)制，及促進(jìn)抗慢性前列腺疼痛藥物的有效開(kāi)發(fā)。 目的：1、觀察L5-S2脊髓段背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)和體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化中p38MAPK的變化，觀察炎性因子水平的變化及與p38MAPK的關(guān)系；2、探討CREB和NF-KB在p38MAPK所致脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞活化中的作用，明確脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞活化中p38MAPK細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及在大鼠慢性前列腺炎疼痛中的作用。 方法：

7、第一部分：p38MAPK在P物質(zhì)刺激脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞體外活化中的作用 分離培養(yǎng)SPF大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞，設(shè)正常對(duì)照組(正常組)、sP刺激組(SP組，10-7mol/L)、SB203580阻斷p38MAPK組(SB組，10μmol/L)和SP刺激+SB203580阻斷p38MAPK組(SP+SB組)。WB法、RT-PCR法、ELISA法檢測(cè)1h，3h，12h，24h和36h時(shí)p38MAPK、p-p38(磷酸化p38MAPK)含量

8、及GFAP mRNA、TNF-α、NO水平和NOS活性的變化。 第二部分：p38MAPK在慢性前列腺炎大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化中的作用 制作大鼠慢性前列腺炎疼痛模型，觀察L5-S2脊髓段背根神經(jīng)節(jié)中p38MAPK和磷酸化p38MAPK含量變化，測(cè)定培養(yǎng)上清液TNF-α、NO、NOS含量，同時(shí)應(yīng)用p38MAPK抑制劑作用于動(dòng)物模型(骶管內(nèi)注射模型)，觀察抑制劑SB203580對(duì)p38MAPK活化與痛性物質(zhì)表達(dá)的

9、影響及關(guān)系。 第三部分：CREB和NF-KB在p38MAPK所致脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞活化中的作用 觀察體外膠質(zhì)細(xì)胞在SP刺激后P-P38、P-CREB、NF-KBp65的變化及關(guān)系，觀察抑制劑SB203580(p38MAPK inhibitor)、PD98059(CREB inhibitor)和SN50(NF-KBinhibitor)對(duì)各信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白活化與痛性物質(zhì)表達(dá)的影響及關(guān)系。分離培養(yǎng)SPF大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞，設(shè)正

10、常組、SP刺激組(SP組，10-7mol/L)、SP刺激+SB203580(10μmol/L)阻斷p38MAPK組(SP+SB組)、SP刺激+PD98059(10μmol/L)阻斷CREB組(SP+PD組)、SP刺激+SN50(10μmol/L)阻斷NF-KB(SP+SN組)。WB法、免疫熒光法、ELISA法檢測(cè)12h和24h時(shí)p-p38、p-CREB、NF-KBp65水平及GFAP、TNF-α、IL-1β水平變化。 結(jié)果與結(jié)論

11、： 第一部分：脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP陽(yáng)性表達(dá)率大于95％。SP組脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞總p38MAPK水平無(wú)顯著變化，1h后P-p38開(kāi)始升高，3h后GFAP mRNA水平顯著增高，同時(shí)NO、NOS和TNF-α水平顯著增高。用SB203580阻斷p38MAPK通路后，SP+SB組較SP組P-p38、GFAP mRNA、NO、NOS、TNF-α水平顯著降低。SB組總p38MAPK、P-p38、GFAP mRNA、NO、NOS、TNF-

12、α水平無(wú)顯著變化。提示p38MAPK信號(hào)通路參與了體外培養(yǎng)脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞P物質(zhì)刺激活化過(guò)程，阻斷p38MAPK信號(hào)通路可有效降低脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞炎性因子水平。 第二部分：前列腺炎組大鼠L5～S2脊髓背角中p-p38、GFAP、TNF-α、NO水平和iNOS活性在5d和10d均明顯高于正常對(duì)照組并隨時(shí)間增高。鎮(zhèn)痛組大鼠L5～S2脊髓背角中P-p38、GFAP、TNF-α、NO水平和iNOS活性在5d和10d均低于前列腺炎組。提示

13、脊髓p38MAPK信號(hào)通路參與了大鼠前列腺炎發(fā)生后脊髓痛覺(jué)傳導(dǎo)及SB203580鎮(zhèn)痛機(jī)制，阻斷p38MAPK信號(hào)通路可有效降低脊髓炎性因子水平。 第三部分：SP組脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞P-p38、p-CREB、NF-KBp65顯著升高，GFAP水平顯著增高，同時(shí)TNF-α和IL-1β水平顯著增高。與SP組比較，用SB203580阻斷p38MAPK通路后，SP+SB組P-p38、P-CREB、NF-kBp65顯著降低，GFAP、TNF-

14、α和IL-1β水平顯著降低。用PD98059阻斷CREB通路后，SP+PD組p-p38、NF-kBp65無(wú)顯著變化，p-CREB顯著降低，GFAP水平降低，同時(shí)TNF-α和IL-1β水平降低。用SN50阻斷NF-kB通路后，SP+SN組p-p38、p-CREB無(wú)顯著變化，NF-kBp65顯著降低，GFAP水平降低，同時(shí)TNF-α和IL-1β水平降低。提示體外培養(yǎng)中，SP刺激后脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞顯著活化，p38MAPK活化后通過(guò)CREB及N