腎上腺髓質(zhì)素在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病大鼠腎臟表達(dá)的研究.pdf

1、目的：糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)患者常見的微血管病變，它與糖尿病視網(wǎng)膜病、神經(jīng)病變一起為糖尿病微血管病變最危險(xiǎn)的并發(fā)癥，其確切的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。本研究用成年雄性Sprague-Dawle大鼠尾靜脈注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)制成糖尿病模型。大鼠4周后處死，以免疫組織化學(xué)SABC法確定大鼠腎上腺髓質(zhì)素(adrenomedu

2、llin，ADM)蛋白表達(dá)水平，用蘇木精伊紅染色法(hematoxylin eosin staining，HE staining)染色光鏡觀察糖尿病腎臟組織的形態(tài)變化，同時(shí)制作大鼠腎臟的電鏡標(biāo)本觀察其超微結(jié)構(gòu)的改變，研究鏈脲佐菌素( streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎臟中ADM的表達(dá)情況，探討糖尿病腎病可能的發(fā)病機(jī)制，并為臨床治療糖尿病腎病提供理論依據(jù)和治療方法。 材料和方法： 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

3、 成年雄性Sprague-Dawle大鼠20只，體重150-180 g，年齡2個(gè)月左右，隨機(jī)分為正常對(duì)照組和糖尿病組，每組10只。 2.實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒?正常組大鼠禁食10h后，尾靜脈注射pH4.6，0.1 mmol/L枸櫞酸鈉緩沖液，劑量為3 ml/kg，作為對(duì)照組；糖尿病組大鼠禁食10h后，用pH4.6，0.1 mmol/L枸櫞酸鈉緩沖液溶解STZ，配成1％溶液，3 ml/kg尾靜脈注射，48 h后尾靜脈取血用血糖檢

4、測(cè)儀測(cè)定血糖，以及尿糖試紙測(cè)尿糖，將血糖≥16.7 mmol/L，尿糖(++)以上的大鼠定為糖尿病模型建立成功的標(biāo)準(zhǔn)；所有動(dòng)物造模后均自由進(jìn)食進(jìn)水，以后每周測(cè)尿糖和血糖。 3.免疫組織化學(xué)染色 (1)取材 造模成功后繼續(xù)飼養(yǎng)4周；在4周后每組各取7只大鼠用戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉；從左心室插管，用PBS(0.01 mol/L，pH7.4)溶液灌注100 ml；接著用4％多聚甲醛(0.01 mol/L，p

5、H7.4)溶液灌注300 ml后，取出腎臟在同種固定液中浸泡30 min，用PBS洗，以上操作均在4℃進(jìn)行。 (2)切片制備 (3)免疫組化實(shí)驗(yàn)及顯色 (4)貼片及封片 4.對(duì)照組用PBS代替一抗，其余步驟相同 5.HE染色 6.透射電鏡觀察腎臟組織超微結(jié)構(gòu) 7.圖像分析與統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 同一放大倍數(shù)(×400)、同一光強(qiáng)度下分析所有切片，每組大鼠各選10張相同部位DAB染色切

6、片，每張切片隨機(jī)測(cè)量5個(gè)視野，測(cè)量結(jié)果取平均值；采用UTHSCSA Image Tools3.0(美國德克薩斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院開發(fā))圖象分析處理系統(tǒng)進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)切片單位面積內(nèi)(mm2)陽性細(xì)胞的數(shù)量和光密度；數(shù)據(jù)采用SPSS10.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，結(jié)果以x±s表示，采用t檢驗(yàn)，p<0.05為顯著性差異。 結(jié)果： 1.體重、血糖與尿糖：糖尿病大鼠建模前，對(duì)照組體重164.2±6.3 g，血糖3,7±0.5 mmol/L，尿糖(

7、-)；糖尿病組體重167.2±7.9 g，血糖3.6±0.4mmol/L，尿糖(-)。兩組間無顯著性差異(P>0.05)。成模后4周：對(duì)照組體重223.8±12.1g，血糖3.9±0.5 mmol/L，尿糖(-)；糖尿病組體重159.1±18.1g，血糖30.4±2.8 mmol/L，尿糖(++)到(+++)。兩組差異有顯著性意義(P<0.01)。 2.腎臟ADM的表達(dá)情況：淺棕黃色ADM免疫陽性顆粒在對(duì)照組與糖尿病組大鼠腎小管

8、上皮細(xì)胞的胞漿內(nèi)均出現(xiàn)。但與對(duì)照組相比，糖尿病組ADM染色增強(qiáng)。具體而言，對(duì)照組大鼠腎臟單位面積ADM免疫陽性細(xì)胞數(shù)和光密度值分別為59.1±14.6/mm2和84.2±8.4，而糖尿病組腎臟單位面積ADM免疫陽性細(xì)胞數(shù)和光密度值分別為197.3±47.4/mm2和117.8±12.9(P<0.01)。 3.腎臟光鏡下HE染色的觀察：光鏡下腎小球的毛細(xì)血管球肥大，腎小囊腔呈裂隙狀，基底膜輕度增厚，系膜增生，腎小管上皮細(xì)胞顯示空泡

9、和顆粒變性。腎小管出現(xiàn)輕度擴(kuò)張，腎小管之間間質(zhì)增寬。 4.腎臟電鏡下超微結(jié)構(gòu)的變化：電鏡下：腎小球毛細(xì)血管基底膜呈節(jié)段性增厚，上皮細(xì)胞部分足突融合、增寬，線粒體明顯腫脹，嵴突數(shù)目減少或斷裂，纖毛破壞，腎組織系膜細(xì)胞局部核內(nèi)染色質(zhì)趨邊濃縮、聚集。 討論： 1.糖尿病大鼠模型制作的研究 建立一種理想的糖尿病動(dòng)物模型，對(duì)于深入研究糖尿病具有重要意義。一般常用四氧嘧啶或鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射一次成模，通常為

10、速發(fā)型大鼠糖尿病模型。其中，STZ的成模更為常用。STZ能直接破壞胰島B細(xì)胞，首先將其DNA堿基上的特殊位點(diǎn)烷基化，之后再進(jìn)一步作用于ADP核糖體合成酶，從而使B細(xì)胞損傷。對(duì)于糖尿病大鼠血糖值的確立標(biāo)準(zhǔn)，通過國內(nèi)外學(xué)者的深入研究，基本傾向于血糖值>16.65 mmol/L(300mg/dl)。本實(shí)驗(yàn)選用SD大鼠空腹10小時(shí)，一次尾靜脈注射STZ3ml/kg，成模4周時(shí)血糖值達(dá)血糖≥16.7 mmol/L以上，并出現(xiàn)多飲、多尿、多食及體重

11、增加不明顯等癥狀，符合速發(fā)型糖尿病大鼠模型標(biāo)準(zhǔn)。 2.糖尿病腎病的病理結(jié)構(gòu)變化 DN典型的病理結(jié)構(gòu)變化為腎臟體積增大和腎小球肥大，并逐漸出現(xiàn)腎小球基底膜增厚以及進(jìn)行性腎小球胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)成份的聚集，最后腎小管間質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)進(jìn)行性積聚。而本研究觀察到光鏡下腎小球的毛細(xì)血管球肥大，腎小囊腔呈裂隙狀，基底膜輕度增厚，系膜增生，腎小管上皮細(xì)胞顯示空泡和顆粒變性。腎小管出現(xiàn)輕

12、度擴(kuò)張，腎小管之間間質(zhì)增寬，腎小球毛細(xì)血管基底膜呈節(jié)段性增厚，上皮細(xì)胞部分足突融合、增寬，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。 3.腎上腺髓質(zhì)素與糖尿病腎病的關(guān)系 ADM是在1993由Kitamura等首次從人嗜鉻細(xì)胞瘤中分離提純成功。近年來ADM在腎臟調(diào)節(jié)中的作用逐漸受到重視，高血糖可增加ADM的表達(dá)。這可能是因?yàn)楦哐羌せ盍薖KC的活性，使ADM表達(dá)增加，而在培養(yǎng)基中加入PKC的抑制劑，高血糖增加ADM表達(dá)的作用就被阻斷。DM的高血糖及

13、高FFA濃度可增加DAG的合成，進(jìn)而激活PKC。而所以腎臟局部ADM表達(dá)的上升很可能是一種機(jī)體的代償機(jī)制，以對(duì)抗糖尿病高血糖條件下代謝紊亂造成的各種損傷信號(hào)，如Ang II系統(tǒng)活化、氧化應(yīng)激增強(qiáng)、PKC過度激活等對(duì)腎臟的不良作用。而長(zhǎng)期慢性高血糖情況下發(fā)生的失代償可能是DM大鼠血漿ADM水平先升高后降低的重要原因。另一項(xiàng)研究顯示，DM大鼠血漿ADM水平呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)，而且ADM的血漿水平被認(rèn)為可以反映DM病變的嚴(yán)重程度。而我