環(huán)孢素A、胰島素對鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠骨轉換及其分子機制影響的研究.pdf

1、環(huán)孢素 A、胰島素對鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠骨轉換及其分子機制影響的研究我們近幾年在臨床上開展的腎活檢、皮膚活檢和肌肉活檢都證明，糖尿病人體內存在廣泛的多器官免疫損傷。多年來，糖尿病的防治都是以高血糖為中心的治療策略，因此糖尿病的慢性并發(fā)癥的發(fā)病機理和臨床處理都處于思想茫然和束手無策的尷尬境地。為弄清糖尿病發(fā)病機制，更好地從疾病的源頭預防和治療糖尿病及其并發(fā)癥，作者開展了糖尿病多器官的病理免疫學的研究并嘗試用環(huán)孢素A進行干預。本實驗是

2、整個研究的一部分。 第一部分 環(huán)孢素A、胰島素對鏈脲佐菌素誘導的糖尿病(DM)大鼠骨轉換影響的研究 目的：1型DM(T1DM)是因胰島素絕對缺乏引起的以高血糖為特征的一組綜合征。其慢性并發(fā)癥包括長時間的慢性骨丟失。既往關于T1DM骨丟失的機制研究表明骨形成減低，而關于骨吸收變化研究結果不一，多數(shù)研究提示，骨吸收減低或無變化，但關于晚期糖基化終末產物(AGEs)作用的研究表明，AGEs主要是刺激骨吸收，故DM骨丟失的機制有

3、待進一步研究。CsA(CsA)是一種免疫抑制劑，可用于器官移植后的抗排斥反應和許多免疫性疾病，包括T1DM早期。隨著DM 腎病腎移植患者增加，CsA 的使用逐漸增多。因此，我們以鏈脲佐菌素(STZ)誘導的DM大鼠為模型，觀察其骨量和骨轉換的變化情況以及胰島素、CsA 干預的影響，同時CsA對于正常大鼠骨量和骨轉換的影響。 方法：62只雄性SD大鼠，隨機分為正常對照組(CON)、正常+低劑量CsA干預組(NL)、正常+高劑量CsA

4、干預組(NH)、單純DM組(DM)，DM+低劑量CsA 治療組(DML)，DM+高劑量CsA治療組(DMH)，胰島素治療組(INS)。以靜脈注射STZ的方法制造DM大鼠模型，各低、高劑量CsA干預組按1mg/kg/d、8mg/kg/d皮下注射 CsA，INS 組按 6U/kg/d 給予中效胰島素皮下注射，成模8周后處死。留取血尿標本分別檢測胰島素、鈣、磷、堿性磷酸酶、骨鈣素和24小時尿鈣。留取左側脛骨近端2/3，行骨形態(tài)計量學分析。分離

5、右側股骨和椎骨(L1-5)，行骨密度測量和骨生物力學試驗。結果：各組大鼠血鈣、磷、堿性磷酸酶水平無顯著差異。STZ誘導的DM大鼠24小時尿量和尿鈣顯著增加，血清骨鈣素水平減低，股骨和腰椎骨密度較正常對照組顯著減低，骨計量形態(tài)學參數(shù)顯示骨小梁骨量顯著減低，動力學參數(shù)表明DM大鼠類骨質表面、骨表面激活頻率、組織水平的骨形成速率顯著減低，力學測試示骨力學性能減低。胰島素干預可使DM大鼠血糖水平下降，24小時尿量和尿鈣水平減低，血清骨鈣素水平增

6、加，股骨和腰椎骨密度增加，骨力學性能改善，骨計量形態(tài)學參數(shù)顯示骨小梁骨量增加，但均未達正常對照組水平。動力學參數(shù)表明胰島素干預可使DM大鼠類骨質表面、骨表面激活頻率、組織水平的骨形成速率增加，可達到正常對照組水平。低劑量CsA干預正常大鼠. 結果：骨密度，骨計量學指標、骨生物力學指標均與正常對照組無顯著差異。高劑量CsA干預正常大鼠，不影響大鼠血糖，骨密度、骨形態(tài)學參數(shù)、骨力學指標較正常對照組下降，同時血清骨鈣素水平、，骨動力學

7、參數(shù)中的類骨質表面、標記表面、組織水平的骨形成速率較正常對照組增加。低劑量CsA干預DM大鼠，骨密度，骨計量學指標、骨生物力學指標均與：DM組無顯著差異。高劑量干預DM大鼠，亦不影響大鼠血糖，可使DM大鼠骨密度和表示骨小梁骨量的形態(tài)學參數(shù)和骨力學性能均進一步減低，同時可使DM大鼠降低的血清骨鈣素水平增加，骨動力學參數(shù)也顯示可使DM大鼠降低的骨形成速率增加。 結論：STZ誘導的DM大鼠骨形成速度減低造成骨量減少，骨力學性能下降。胰

8、島素治療可通過刺激骨形成，增加DM大鼠骨量，改善骨力學性能。低劑量CsA不影響正常大鼠和DM大鼠骨量、骨力學性能和骨轉換狀況。高劑量CsA干預正常大鼠可能誘發(fā)高轉換型骨量丟失和骨力學性能減低。高劑量CsA干預8周可使DM大鼠骨丟失進一步加重，并使DM大鼠低轉換型骨丟失向高轉換型骨丟失轉變。 第二部分 環(huán)孢素A、胰島素對鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠骨轉換分子機制影響的研究 目的：T1DM 的一個重要的慢性并發(fā)癥就是慢性的骨丟

9、失。TlDM 導致骨丟失的作用機制主要是骨形成速度減慢，關于骨吸收的變化情況有待進一步明確。本研究擬通過檢測STZ誘導的DM大鼠和胰島素、CsA干預后的大鼠骨組織中標志破骨活性的核因子-κ B受體激活物配基(RANKL)/護骨素(OPG)mRNA水平和標志成骨細胞分化晚期的骨鈣素(OC)mRNA水平，以及調控成骨細胞分化成熟的轉錄因子核結合因子1(Cbfal)、OSX mRNA 的表達水平，分析DM大鼠骨丟失的分子機制和胰島素、CsA干

10、預對其的影響。在增齡和廢用性骨質疏松時，骨組織中脂肪組織形成增加而成骨細胞生成或成熟減少導致骨丟失。既往有研究顯示，STZ誘導的DM小鼠外周組織脂肪含量減少，但骨髓中脂肪增加伴骨量減少。因而本研究擬通過計數(shù)大鼠骨髓脂肪細胞數(shù)量，同時檢測骨組織中標志脂肪細胞的過氧化物酶增殖激活物受體γ2(PPAR γ 2)mKNA 表達水平，證實骨量減少是否與DM狀態(tài)下這種脂肪轉移機制有關，并分析胰島素和CsA干預分別對其有何影響。 方法：實驗動

11、物和分組同上。分離右側脛骨近端1/3(去除骨骺)，提取骨組織總 RNA，用實時熒光定量 RT-PCR 的方法檢測大鼠骨組織中RANKL，OPG，OC，Cbfal，OSX 和 PPAR γ2 mRNA的表達水平，分離左側股骨近端1/2，制做脫鈣骨切片，計數(shù)骨髓中脂肪細胞數(shù)量。 結果：STZ誘導的DM大鼠骨組織中標志骨吸收的RANKL/OPG mRNA 水平和標志成骨細胞分化成熟晚期的OC以及調控成骨的轉錄因子 OSX、Cbfalm

12、RNA水平顯著減低，而標志脂肪細胞的 PPAR<,γ2>mRNA 水平顯著增加，骨髓脂肪細胞計數(shù)增加伴皮下、肝臟脂肪減少。胰島素干預可使DM大鼠骨組織中OC、OSX、Cbfal mRNA 水平增加，而不影響骨組織中 RANKL/OPG mRNA 水平，同時可使DM大鼠骨組織中標志脂肪細胞的PPAR<,γ2>mRNA水平下降，骨髓脂肪細胞計數(shù)減少。CsA 干預結果顯示，低劑量不影響正常大鼠和DM 大鼠骨組織中所研究的各因子mRNA水平和骨

13、髓脂肪細胞計數(shù)。高劑量8周可使正常大鼠和DM 大鼠骨組織中RANKL/OPG mRNA 水平和OC、OSX mRNA水平均增加，但骨組織中Cbfal mRNA 水平無顯著變化，也不影響正常和DM大鼠骨組織中標志脂肪細胞的PPAR<,γ2> mRNA 水平和骨髓脂肪細胞計數(shù)。 結論：所研究的DM大鼠骨組織中骨吸收和骨形成的各標志因子mRNA水平均下降，考慮為低轉換型骨量丟失。同時，骨組織中標志脂肪細胞的PPAR<,γ2>mRNA

14、水平和骨髓脂肪細胞計數(shù)增加，而DM大鼠皮下、肝臟脂肪減少，提示這種脂肪轉移機制可能也存在于DM大鼠骨丟失過程中。胰島素干預可使DM大鼠骨組織中標志成骨活性的各因子mRNA水平增加，而對標志骨吸收的RANKL/OPG mRNA 水平無影響，提示胰島素主要通過刺激骨形成而非抑制骨吸收增加 DM 大鼠骨量。同時胰島素組骨組織中PPAR<,γ2> mRNA和骨髓脂肪細胞計數(shù)減少，提示胰島素可能抑制骨髓多能間充質干細胞向脂肪細胞分化，促進其向成骨