鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠外周神經(jīng)病變免疫損傷和環(huán)孢素A的抑制作用.pdf

1、鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠外周神經(jīng)病變免疫損傷和環(huán)孢素A的抑制作用我們近幾年在臨床上開展的腎活檢、皮膚活檢和肌肉活檢都證明，糖尿病人體內(nèi)存在廣泛的多器官免疫損傷。多年來，糖尿病的防治都是以高血糖為中心的治療策略，因此糖尿病的慢性并發(fā)癥的發(fā)病機理和臨床處理都處于思想茫然和束手無策的尷尬境地。為弄清糖尿病發(fā)病機制，更好地從疾病的源頭預防和治療糖尿病及其并發(fā)癥，作者開展了糖尿病多器官的病理免疫學的研究并嘗試用環(huán)孢素A進行干預。本實驗是整個研究

2、的一部分。 目的：糖尿病外周神經(jīng)病變(diabetes peripheral neuropathy,DPN)是糖尿病常見的慢性并發(fā)癥之一，神經(jīng)電生理檢查證實90％的糖尿病患者存在DPN。一般認為高血糖是DPN發(fā)生的主要原因，氧化應激是糖尿病及其慢性并發(fā)癥發(fā)生的共同環(huán)節(jié)，然而臨床實踐證實強化血糖控制未能從根本上阻止DPN的發(fā)生與進展。我們的研究工作證實，STZ誘導的糖尿病大鼠存在多器官免疫損傷，活檢發(fā)現(xiàn)糖尿病患者的腎臟、皮膚和肌肉

3、均存在免疫球蛋白的沉積，因此我們推測糖尿病及其慢性并發(fā)癥的發(fā)生可能是多器官免疫損傷的結果，感染—免疫—炎癥—器官損傷—功能障礙是疾病發(fā)生和發(fā)展的共同規(guī)律。 若干研究證實，糖尿病患者血循環(huán)中可檢測到針對神經(jīng)系統(tǒng)自身成分的抗體，同時血液中的補體成分顯著降低，這些抗體能否造成神經(jīng)組織的損傷，補體系統(tǒng)的激活是否參與了DPN的發(fā)生目前均無定論。核因子-κB(NF-κB)是氧化應激下游啟動最早，也是最重要的轉錄調(diào)節(jié)因子，是聯(lián)系氧化應激與炎癥

4、反應的樞紐，免疫損傷是否參與了神經(jīng)組織局部氧化應激的發(fā)生，CsA能否抑制氧化應激及下游NF-κB的激活?已經(jīng)證實，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)參與了糖尿病視網(wǎng)膜病變和糖尿病腎病的發(fā)生，抑制TNF-α在視網(wǎng)膜的表達可延緩糖尿病視網(wǎng)膜病變的進展，CsA能否抑制TNF-α在神經(jīng)組織的表達尚未見相關報道。 本研究擬從DPN可能存在的免疫損傷入手，以鏈脲佐菌素(STZ)誘導的糖尿病大鼠為模型，分別從脊髓、脊髓背根神經(jīng)節(jié)(DRG)和坐骨神

5、經(jīng)三個部位，評價DPN發(fā)生過程中神經(jīng)組織局部的免疫學異常及其與氧化應激、炎癥的關系，觀察CsA對DPN的治療效果，探討免疫學機制在DPN發(fā)病機制中的作用，為臨床防治DPN提供一定的依據(jù)。 方法：90只雄性SD大鼠，隨機分為正常對照組(CON)、糖尿病組(DM)、低劑量CsA治療組(ML)、中劑量CsA治療組(MM)、高劑量CsA治療組(MH)和胰島素強化治療組(MI)。以靜脈注射STZ的方法制造糖尿病大鼠模型，成模后ML、MM和

6、MH組分別按照0.5 mg/kg-d、1 mg/kg·d和2 mg/kg·d皮下注射CsA，MI組根據(jù)血糖水平給予皮下注射 2-6U/d中效胰島素，成模16周后處死。留取血、尿標本分別檢測肝功能、腎功能、胰島素、尿蛋白和尿微量白蛋白；觀察脊髓、DRG 和坐骨神經(jīng)形態(tài)學變化；采用免疫組化和免疫熒光兩種方法評價脊髓、DRG和坐骨神經(jīng)免疫球蛋白 G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)和補體C3b 的表達；測定神經(jīng)組織丙二

7、醛(MDA)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、銅鋅超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)水平；采用免疫組化方法測定上述部位NF-κB 蛋白表達；采用 RT-PCR 和免疫組化方法測定上述部位TNF-αmRNA 和蛋白表達水平。 結果：所有造模大鼠全部成模，實驗期間低中高劑量的CsA干預治療均未造成大鼠肝腎功能損傷。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，16周齡糖尿病大鼠存在坐骨神經(jīng)髓鞘崩解和軸突萎縮

8、，證實已經(jīng)發(fā)生 DPN。DM 組大鼠軸突/髓鞘面積比值顯著低于CON組，中高劑量的CsA和胰島素治療均可延緩此種改變，低劑量CsA干預不能有效改善上述異常。 糖尿病大鼠脊髓、DRG和坐骨神經(jīng)均存在IgA、IgG、IgM和補體C3b的異常沉積，坐骨神經(jīng)XgA、IgG和C3b平均光密度值與軸突/髓鞘面積比值存在顯著負相關；中高劑量的CsA治療可有效抑制上述物質在神經(jīng)組織的沉積，胰島素治療不能糾正此種異常改變，低劑量CsA干預僅對上述

9、部分指標有效。 糖尿病大鼠脊髓、DRG 和坐骨神經(jīng)局部 MDA 水平顯著升高，DRG 和坐骨神經(jīng) T-SOD、CuZn-SOD、CAT 和 GSH-Px 水平均顯著降低，脊髓僅 CuZn-SOD和 GSH-Px 水平顯著降低；中高劑量的 CsA 和胰島素治療均可改善上述異常；糖尿病大鼠神經(jīng)組織局部NF-κB蛋白表達、TNF-αmRNA 和蛋白表達均顯著增高，中高劑量的 CsA 和胰島素治療均可抑制 NF-κB的表達，但僅中高劑量

10、的CsA 能顯著降低TNF-αmRNA 和蛋白的表達。低劑量CsA治療僅對上述部分指標有效。 結論：16周齡STZ誘導的糖尿病大鼠脊髓、DRG 和坐骨神經(jīng)均存在免疫球蛋白和 C3b 的異常沉積，證實體液免疫反應參與了 DPN 的發(fā)生；1mg/kg·d、2mg/kg·d CsA 免疫干預治療可有效減少神經(jīng)系統(tǒng)上述部位免疫球蛋白和補體C3b的沉積，而胰島素治療不能改善此種免疫異常，提示此種免疫異常獨立于高血糖之外發(fā)揮作用。

11、16周齡STZ誘導的糖尿病大鼠脊髓、DRG和坐骨神經(jīng)均存在氧化應激水平的增高、NF-κB 的激活和下游TNF-α高表達；1mg/kg·d、2 mg/kg·d CsA 免疫干預治療可有效抑制上述異常改變，且對WSF-α的抑制作用優(yōu)于胰島素治療，提示免疫系統(tǒng)激活與高血糖可能均為氧化應激的上游機制，而在抑制氧化應激下游炎癥因子異常表達方面CsA效果更好。 1 mg/kg·d和2 mg/kg·d CsA免疫抑制治療均能有效地延緩DPN的