產黃青霉突變體庫的構建及鑒定.pdf

1、青霉素是抗生素領域重要戰(zhàn)略品種之一，產黃青霉(Penicillium chrysogenum)是生產青霉素的真菌，具有極其重要的工業(yè)價值。目前工業(yè)上使用的菌株是P.chrysogenumNRRL1951經多輪誘變育種得來的，青霉素產量較原始出發(fā)菌已提高了近千倍，因此目前傳統(tǒng)的菌種改造和發(fā)酵調控難以使P.chrysogenum的青霉素水平有較大提高。為了獲得更高的產量，應用基因工程技術將P.chrysogenum改良成為適于青霉素工業(yè)生產

2、成為目前的主要研究任務。本實驗旨在應用基因工程技術改良P.chrysogenum工業(yè)菌株，以期在原有青霉素產量上有所突破，使青霉素產量提高。
　　本實驗采用工業(yè)產黃青霉(P.chrysogenum)為出發(fā)菌株，應用原生質體融合法將外源博來霉素抗性基因通過PCR合成的T-DNA介導轉化產黃青霉(P.chrysogenum)，通過抗生素平板篩選獲得大量轉化子，為篩選青霉素高產突變株奠定了基礎。為確定外源基因是否導入，采用簡便的高通量基

3、因組提取方法，以酶解法為基礎，結合超聲處理與高溫加熱處理的方式，提出較高質量的基因組DNA，后進行PCR反應。結果表明應用混合酶液酶解效果最佳，其中蝸牛酶終濃度6 mg/mL纖維素酶終濃度4000 U/mL，超聲處理10-15 min，28℃酶解14h，最后90-98℃加熱10-15 min，然后加入50-100μLddH2O混勻，靜置直至分層，取上清直接PCR，得到了清晰準確的條帶。
　　對所構建的P.chrysogenum突變