燕麥EMS突變體庫的構(gòu)建及分析.pdf

1、燕麥?zhǔn)侵匾募Z飼兼用作物，構(gòu)建燕麥EMS突變體庫對(duì)燕麥功能基因組學(xué)研究和遺傳改良有重要意義。本實(shí)驗(yàn)利用化學(xué)誘變劑甲基磺酸乙酯(EMS，ethyl methane sulfonate)處理燕麥品種花早2號(hào)，對(duì)M2植株進(jìn)行全生育期調(diào)查，對(duì)部分株系進(jìn)行突變位點(diǎn)的分子檢測(cè)，主要結(jié)果如下:
　　1、燕麥EMS處理和突變類型鑒定。利用濃度為0.7％的EMS溶液處理花早2號(hào)種子15h，獲得了4083株的M1材料;對(duì)其中的2000個(gè)單株種植M2株

2、行，并進(jìn)行全生育期調(diào)查，鑒定其表型變化;對(duì)其中2份黃化突變材料種植了M3家系，進(jìn)行黃化突變性狀的穩(wěn)定性驗(yàn)證。結(jié)果表明，燕麥經(jīng)EMS處理后表型變異巨大，在M2代材料共發(fā)現(xiàn)表型突變材料196份，表型變異率為9.8％，變異類型非常豐富，包括幼苗習(xí)性、葉片、分蘗數(shù)、株高、穗部形態(tài)以及成熟期等多個(gè)突變類型。其中，對(duì)部分M3材料種植后證實(shí)，突變的黃化苗特性可以穩(wěn)定遺傳。
　　2、燕麥突變體庫的TILLING檢測(cè)。從芹菜中提取CELⅠ內(nèi)切酶粗提

3、物，以合成的含有單個(gè)堿基差異的片段為模板對(duì)提取的CELⅠ內(nèi)切酶進(jìn)行活性檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所提取的內(nèi)切酶具有較高的活性;同時(shí)，對(duì)酶切反應(yīng)的溫度、酶切時(shí)間、提取物的用量等條件進(jìn)行探索，構(gòu)建了酶切檢測(cè)體系。利用該體系，對(duì)突變體庫進(jìn)行TILLING檢測(cè)，共篩選出兩個(gè)與黃化苗相關(guān)突變位點(diǎn)。
　　3、突變體的HRM檢測(cè)。根據(jù)水稻黃化基因和株高基因進(jìn)行特異性引物設(shè)計(jì)98對(duì)引物，最終篩選出6對(duì)引物可以擴(kuò)增出單一條帶。以這6對(duì)引物對(duì)表型發(fā)生變異的部分M

4、2材料進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物利用HRM檢測(cè)，共檢測(cè)到25個(gè)黃化突變位點(diǎn)。對(duì)這些突變樣品進(jìn)行克隆測(cè)序，與野生型相比，其中有19個(gè)位點(diǎn)的DNA序列發(fā)生變異。對(duì)測(cè)序片段進(jìn)行BLAST序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)有4個(gè)樣品的擴(kuò)增片段與燕麥chlG基因的部分片段僅有單堿基差異，該基因(chlG)為葉綠素合成酶基因。其中黃化突變體M0368、M0782、M1888和M1910種植M3株系，結(jié)果表明這一突變性狀能夠穩(wěn)定遺傳。
　　以上結(jié)果表明，本研究構(gòu)建了燕麥花