大豆突變體庫(kù)的構(gòu)建及子葉折疊突變相關(guān)基因的初步研究.pdf

1、大豆[Gtycinemax(L.)Merr.]是世界上最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，由于基因組結(jié)構(gòu)復(fù)雜、遺傳轉(zhuǎn)化效率低等原因限制了其功能基因組研究的發(fā)展。但隨著大豆基因組測(cè)序的初步完成，大豆功能基因組研究將成為研究的重點(diǎn)。突變體是基因功能研究的重要材料，也是大豆遺傳改良的基礎(chǔ)材料，鑒于此，本研究利用疊氮化鈉，60Coγ射線，甲基磺酸乙酯等方法處理大豆品種“南農(nóng)86-4”，“南農(nóng)87c-38”和“南農(nóng)94-16”，以初步構(gòu)建大豆突變體庫(kù)，并對(duì)其中

2、一個(gè)子葉突變體開(kāi)展了較系統(tǒng)的研究。主要結(jié)果如下： 1、大豆突變體庫(kù)的構(gòu)建 對(duì)3個(gè)品種的M2、M3世代的突變體進(jìn)行了表型性狀調(diào)查和分析，都獲得包括葉、莖、花、種子等性狀變異的材料，其中“南農(nóng)86-4”葉變異120份、莖變異24份、花變異26份、種子變異9份、熟期及育性變異6份，共185份；“南農(nóng)87c-38”葉變異10份、莖變異4份、花變異3份、種子變異3份、熟期及育性變異42份，共62份；“南農(nóng)94-16”葉變異84份、

3、莖變異3份、花變異10份、種子變異21份、熟期及育性變異2份，共120份.對(duì)部分突變體的蛋白質(zhì)及油分含量進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)“南農(nóng)86-4”突變系蛋白質(zhì)含量范圍為：39.5％～52.5％，油分含量范圍為：15.3％～22.9％，“南農(nóng)94-16”突變系蛋白質(zhì)含量范圍為：39.1％～48.1％，油分含量范圍為：17.3％～22.2％。 2、大豆子葉突變體的鑒定與分析 1)農(nóng)藝品質(zhì)性狀 對(duì)通過(guò)NaN3-60Coγ射線誘變

4、“南農(nóng)94-16”獲得的子葉折疊突變體進(jìn)行農(nóng)藝性狀綜合調(diào)查，發(fā)現(xiàn)該突變體表現(xiàn)為子葉向外折疊，種皮部分皺縮，比對(duì)照品種晚熟9天左右，而其它表型無(wú)明顯差異。子葉形態(tài)觀察結(jié)果表明，突變體子葉折疊形態(tài)是在種子發(fā)育初期由于子葉伸展受到抑制形成.蛋白質(zhì)測(cè)定表明，突變體蛋白質(zhì)含量比對(duì)照高3個(gè)百分點(diǎn)。氨基酸組份分析表明，與對(duì)照相比，突變體的17種氨基酸中除絲氨酸含量沒(méi)有明顯變化，脯氨酸、蘇氨酸、酪氨酸含量有一定的降低外，其它13種氨基酸含量都增加，尤其

5、是蛋氨酸含量增加33％以上，游離氨基酸測(cè)定結(jié)果表明，突變體比對(duì)照含量高74％以上. 2)遺傳分析 通過(guò)雜交對(duì)子葉折疊突變體進(jìn)行遺傳分析，F(xiàn)2結(jié)果分析表明，該性狀由兩對(duì)隱性細(xì)胞核基因控制. 3)基因組水平分析 為了總體了解子葉折疊突變體與對(duì)照在基因組水平上的差異，本研究對(duì)突變體及對(duì)照的基因組DNA進(jìn)行了SSR標(biāo)記分析。篩選大豆SSR標(biāo)記共957對(duì)，結(jié)果顯示有9對(duì)標(biāo)記表現(xiàn)差異，這些標(biāo)記集中分布在三個(gè)連鎖群B1

6、、D2、G的三個(gè)位點(diǎn)上。據(jù)前人研究結(jié)果分析，B1連鎖群上的標(biāo)記Satt426附近有蛋白質(zhì)與油分的QTL；G連鎖群上的Satt163、Satt038、Sat_168、Satt570、AW734137標(biāo)記附近有種子性狀的QTL. 為了發(fā)現(xiàn)突變體與對(duì)照在基因組水平上的差異，本研究運(yùn)用比較基因組雜交芯片(AffymetrixRGeneChip)進(jìn)行分析，對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果以信號(hào)值相差1.2倍為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，獲得明顯差異的19個(gè)候選基因，其中突變

7、體比對(duì)照雜交信號(hào)值增強(qiáng)的有10個(gè)基因，突變體比對(duì)照雜交信號(hào)值減弱的有9個(gè)基因，參考其它作物的研究結(jié)果，對(duì)這些基因進(jìn)行了初步的功能預(yù)測(cè)，突變體比對(duì)照雜交信號(hào)增強(qiáng)的10個(gè)基因中有7個(gè)基因編碼的蛋白為未知蛋白，3個(gè)基因編碼的蛋白預(yù)測(cè)為已知蛋白。3個(gè)已知蛋白的功能分別為：天冬氨酸-tRNA連接酶，UDP-葡糖基轉(zhuǎn)移酶，EF-hand鈣結(jié)合蛋白CCD1。突變體比對(duì)照雜交信號(hào)減弱的9個(gè)基因中有3個(gè)基因編碼的蛋白為未知蛋白，6個(gè)基因編碼的蛋白預(yù)測(cè)為已

8、知蛋白。6個(gè)已知蛋白的功能分別為：亮氨酸氨基肽酶，翻譯起始因子，核糖體蛋白，Dof鋅指蛋白，丙酮酸脫氫酶，細(xì)胞色素P450單氧酶。為了從中發(fā)現(xiàn)可能與子葉形態(tài)密切相關(guān)的基因，我們用RT-PCR對(duì)19個(gè)候選基因在開(kāi)花后30天的種子中進(jìn)行了差異表達(dá)研究。其中突變體比對(duì)照雜交信號(hào)值增強(qiáng)的10個(gè)基因中，Gma.15488的表達(dá)結(jié)果與CGH芯片結(jié)果一致，但Gma.15488編碼的蛋白為未知蛋白，突變體比對(duì)照雜交信號(hào)值減弱的9個(gè)基因中，TC20889

9、7的表達(dá)結(jié)果與CGH芯片結(jié)果一致，TC208897編碼的蛋白為Dof鋅指蛋白。19個(gè)基因中除了這兩個(gè)基因外，其它基因或者全部沒(méi)有表達(dá)，或者表達(dá)水平一致，說(shuō)明這兩個(gè)在子葉中差異表達(dá)的基因最有可能與子葉的異常發(fā)育相關(guān)，但需要進(jìn)一步驗(yàn)證。 4)子葉突變對(duì)大豆種子蛋白組成的影響 為了研究子葉折疊性狀可能對(duì)種子貯藏蛋白組成的影響，本研究運(yùn)用雙向電泳技術(shù)對(duì)由三種不同處理方式獲得的表型相似的子葉折疊突變體進(jìn)行比較研究，獲得3個(gè)共同的差