hKLK1基因轉移對血管平滑肌細胞增殖、遷移和球囊損傷后SHR頸動脈新生內膜的影響.pdf

1、目的構建含人組織激肽釋放酶(human tissue kallikrein 1，hKLKl)基因的重組腺病毒載體及檢測其在自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHR)的血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)中表達；探討hKLKl基因轉移對血小板源性生長因子-BB(platelet derived growth factor-BB,PDGF-BB

2、)誘導下的VSMCs增殖、遷移和球囊拉傷后SHR頸總動脈新生內膜的影響及其機制。 方法：1 通過雙酶切含目的基因hKLKl的質粒pBluescritll KS-hKLKl，將目的基因克隆至帶有強綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)基因為報告基因的穿梭質粒中，構建成重組穿梭質粒，與腺病毒骨架質粒在293A細胞中包裝成雙順反子重組腺病毒載體。 2.組織塊體外培養(yǎng)SHR

3、大鼠胸主動脈VSMCs，采用熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測病毒感染率；RT-PCR法測定hKLKl和緩激肽B1受體、B2受體的mRNA表達、；蛋白免疫印跡法(Western-blotting，WB)測定hKLKl和細胞周期素依賴性激酶抑制蛋白p27Kipl、p21Cipl的表達。 3.細胞計數法和四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法檢測細胞增殖，流式細胞儀檢測細胞生長周期；采用改良Boyden微孔膜雙槽法測定VSMCs遷移。 4

4、動物實驗：30只350-450g雄性SHR隨機分為四組：假手術組6只、單純拉傷組8只、拉傷+空載體病毒組8只、拉傷+A.d-hKLKl組8只。除假手術組外，其余各組用2F球囊導管從頸外動脈進入頸總動脈并拉傷，將Ad-hKLKl重組腺病毒和空載體病毒(1×109IU/只，在50μl病毒保存液里)，用微量注射器迅速注入動脈損傷段，孵育30-45分鐘后恢復血流。4周術處死后大鼠，冰凍切片在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光表達；HE染色，計算機圖像分析

5、頸總動脈，計算血管壁腔面積比(W/L)，內膜/中膜面積比(I/M)；RT-PCR法檢測頸動脈緩激肽受體B1和B2的表達，WB法檢測動脈hKLKl和p27Kipl、p21Cipl的蛋白表達。 結果： 第一部分：經PCR、雙酶切和測序鑒定表明，攜目的基因hKLKl的重組穿梭質粒pDC316-hKLK1-IRES-EGFP構建正確，并與骨架質粒在293A細胞中成功包裝出重組腺病毒Ad-hKLK1-IRES-EGFP和空載體病毒

6、Ad-IRES-EGFP。重組腺病毒感染VSMCs后，熒光顯微鏡下觀察到明亮綠色熒光，呈感染復數(multiplicity ofinfection，MOI)(20-100MOI)和時間(1d-5d)依賴性增強；流式細胞儀結果示，VSMCs感染率也隨MOI遞增而增加，當MOI為100，感染率達99％。RT-PCR、wB檢測結果示：VSMCs中hKLK1的mRNA和蛋白均有表達，也與感染時間呈顯著依賴關系，3-5天達峰值：MOI為100時h

7、KLK1的表達達高峰。 第二部分： 1.hKLK1基因轉移對PDGF誘導的VSMCs的增殖影響： 1)通過細胞計數顯示，hKLKl基因轉移呈感染復數依賴性(20-IOOMOI)抑制PDGF-BB誘導的VSMCs生長，100MOI時抑制率為39.3％；同時呈時間依賴性抑制VSMCs生長，第5天時達高峰，抑制率為35.2％?？蛰d體病毒組和單純PDGF-BB組之間未見明顯差異。 2)MTT法和流式細胞儀檢測的結

8、果顯示，hKLK1基因轉移可顯著抑制PDGF-BB誘導的VSMCs增殖，峰值抑制率為30.2％(P<0.01)；細胞周期阻滯于GO/G1期的VSMCs明顯增多，最大阻滯率為36.4％(P(0.001)。同時，hKLK1基因轉移可明顯上調PDGF-BB誘導VSMCs的p27Kip1、p21Cip1表達。而緩激肽B2受體特異性阻斷劑Hoel40明顯消除hKLKl基因轉移對VSMCs增殖和細胞周期的抑制作用，并降低p27Kip1、p21Cip

9、1表達。 2.hKLKl基因轉移可明顯抑制PDGF-BB誘導的VSMCs細胞遷移，抑制率34.6％，而Hoe140不影響其抑制遷移效應。 3.PDGF-BB誘導VSMCs的緩激肽B2受體的mRNA表達明顯增加(p<0.001)；而Hoe140可明顯降低其表達(p<0.01)，與對照組間無顯著性差異。緩激肽B1受體的mRNA表達在各組間無明顯性改變。 第三部分： 1.hKLK1基因轉移可明顯改善球囊拉傷后大

10、鼠頸總動脈的壁腔面積比(W/L)，抑制率達35.6％(P<0.001)；內膜/中膜面積比(I/M)改善達35.8％(P<0.001)。而在單純拉傷組和空載體病毒組之問無顯著差異。 2.hKLK1基因轉移能增加頸總動脈內p27Kip1、p21Cip1的蛋白表達(p<0.001)，而單純拉傷組和空載體病毒組之間無顯著差異。 3.球囊拉傷后頸動脈的緩激肽B2受體的mRNA表達明顯高于假手術組(p<0.01)，而各組問的緩激肽B

11、1受體的mRNA表達無顯著性差異。 結論： 1.成功構建并包裝含目的基因hKLK1和標志基因EGFP的雙順反子重組腺病毒載體Ad-hKLK1-IRES-EGFP，兩基因在VSMCs上均獲得高表達，為hKLK1基因治療研究提供直觀、快捷的觀察和檢測手段。 2.hKLK1基因轉移可抑制PDGF一BB誘導的VSMCs增殖，主要由緩激肽B2受體介導的，通過上調細胞周期素依賴性激酶抑制蛋白p27Kip1、p21Cip1表達

12、的途徑。而hKLK1基因轉移抑制VSMCs遷移效應，可能由緩激肽B1受體介導。 3.在球囊拉傷SHR頸動脈的血管再狹窄模型中，hKLK1基因轉移主要也是通過緩激肽B2受體介導的下游途徑，上調p27Kip1、p21Cip1的表達，從而抑制新生血管壁的增厚。 4 本研究提示，hKLK1基因轉移減輕SHR頸動脈球囊損傷后的新生血管內膜形成?？赡苤饕删徏る腂2受體介導的，通過上調p27Kip1、p21Cip1的表達，抑制VSM