自噬對血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、目的：探討自噬作用與血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)增殖之間的關(guān)系。為防治VSMC異常增殖提供新的理論依據(jù)。
　　 實驗方法：用健康SD大鼠的腹主動脈進(jìn)行VSMC的原代培養(yǎng)，培養(yǎng)基選用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM，培養(yǎng)條件為5％CO2、37℃。培養(yǎng)3～5天有細(xì)胞爬出，7～9天左右可進(jìn)行第一次傳代。根據(jù)檢測方法的不同可分為：①用于免疫細(xì)胞化學(xué)檢測的細(xì)胞接種于放有小圓玻片的24孔板內(nèi)，細(xì)胞按5×104個/ml細(xì)胞密度，每孔1ml。

2、②用于免疫印跡檢測的細(xì)胞接種于50ml培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞按5×105個/ml細(xì)胞密度，每瓶3ml。實驗選用3～6代VSMC，VSMC傳代后靜置培養(yǎng)16 h，等細(xì)胞完全貼壁后換用含0．5％FBS的DMEM培養(yǎng)24 h進(jìn)行同步化處理(使所有細(xì)胞處于細(xì)胞周期的靜止期)，隨后分為七個組：①對照組；②雷帕霉素(RPM)組(10 ng/ml)；③3—甲基腺嘌呤(3—MA)組(10 ng/ml)：④凝血酶(F2)組(1 U/ml)；⑤雷帕霉素(10 ng

3、/ml)+凝血酶組(1 U/ml)；⑥3—MA(10 ng/ml)+凝血酶組(1U/ml)；⑦雷帕霉素(10 ng/ml)+胃酶抑素(Pep)組(0．01μ mol/ml)。不同藥物處理后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，通過免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫印跡方法檢測各組VSMC的增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)和微管相關(guān)蛋白輕鏈3(LC3)的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：
　　 一．自噬對VSMC增殖的影響
　　 實驗分別用雷帕霉素和3—MA作用VS

4、MC，用免疫細(xì)胞化學(xué)和Western Blot方法檢測PCNA、LC3表達(dá)變化，結(jié)果表明：雷帕霉素作用VSMC后與對照組相比能明顯抑制其增殖(P<0．01)，而3—MA則促進(jìn)VSMC增殖(P<0．01)。
　　 Western Blot檢測PCNA蛋白表達(dá)結(jié)果進(jìn)一步表明F2能促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖，但與雷帕霉素共同作用時，F(xiàn)2的促平滑肌增殖作用大大降低(P<0．01)，3—MA與F2共作用時有促VSMC增殖作用。
　　 二

5、．增殖因素(F2)對VSMC自噬與增殖的影響
　　 凝血酶(F2)是促VSMC增殖劑，在VSMC中加入F2后LC3表達(dá)有所降低，PCNA的表達(dá)明顯上調(diào)；F2與雷帕霉素共同作用時，LC3的表達(dá)明顯上升，而PCNA則顯著下調(diào)；但與單獨使用雷帕霉素組相比LC3的表達(dá)量又有一定降低，F(xiàn)2與3—MA同時作用時，自噬被抑制，而PCNA明顯上調(diào)，與單獨使用3—MA的組相比LC3的表達(dá)量也有一定降低。
　　 三．自噬抑VSMC增殖的機(jī)制

6、研究
　　 實驗選用胃酶抑素抑制溶酶體途徑，檢測LC3、PCNA的表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胃酶抑素與雷帕霉素共同作用時，LC3表達(dá)上調(diào)，而PCNA的表達(dá)與雷帕霉素組相比明顯上調(diào)，與3—MA組相比PCNA表達(dá)更顯著。
　　 結(jié)論：
　　 1、雷帕霉素的抑VSMC作用與自噬激活有關(guān)，自噬作用能抑制VSMC增殖。
　　 2、促進(jìn)細(xì)胞增殖因素(F2)有降低自噬水平的作用，但效果不顯著。
　　 3、自噬抑VSM