miR-3568對血管平滑肌細胞增殖和遷移的影響及分子機制研究.pdf

1、目的：動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)被定義為一種慢性炎癥性血管疾病，其發(fā)生機制目前仍不完全清楚?；趯用}粥樣硬化發(fā)病原因的研究，其發(fā)病過程中主要是血管腔由脂質堆積而變得狹窄，狹窄過程中有多種因素參與其中并發(fā)揮作用。如炎癥細胞及相關生長因子、脂質循環(huán)與累積、血清與機械力刺激等。在這些因素作用下，首先導致內皮細胞功能障礙，受損的內皮會有趨化因子分泌，并在內膜開始募集炎性因子。其次是單核細胞浸潤，活化巨噬細胞釋放炎性介

2、質，內膜受到進一步損傷，最后在內膜層有血管平滑肌細胞移行和增殖的現象發(fā)生，造成管壁斑塊的形成。所以，血管平滑肌細胞(Vascular Smooth Muscle Cell，VSMC)的增殖與遷移是斑塊形成與脫落并造成血栓的重要環(huán)節(jié)，防止平滑肌細胞過度的增殖與遷移是阻斷AS發(fā)生的關鍵。
　　目前已有大量的研究結果表明，AS的發(fā)生機制主要是由于內皮細胞的受損、脫落，致使血小板附著于損傷處，并伴有血小板衍生生長因子(Platelet-D

3、erived Growth Factor，PDGF)的釋放，刺激動脈的VSMC由原來所處的位置逐步向內膜的移行、增生等。移行與增生的VSMC和大量沉積的脂質共同導致了AS疾病的發(fā)生，因此VSMC在AS發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著不可缺少的作用。然而VSMC的影響因素有很多，本文主要探究微小核糖核酸對其功能的影響。
　　微小核糖核酸(microRNA或miRNA)是一種非編碼的單鏈小RNA分子，在動植物的基因組中均有所表達。對miRNA的生

4、物學功能的研究與了解是不斷發(fā)展的，作為一種調節(jié)因子，主要參與到轉錄后基因的表達，同時是一種負調控因子。其作用機制是具有選擇性的，可以直接對靶標信使RNA降解，或者降低信使RNA的穩(wěn)定性，從而發(fā)揮其相應的功能。近年來對于miRNA的研討有很多，心血管疾病尤其是動脈粥樣硬化疾病的發(fā)生發(fā)展與miRNA的關系越來越密切。而miRNA-3568是近年新發(fā)現的一種單鏈小分子RNA，與心血管疾病尤其是動脈粥樣硬化疾病的發(fā)生發(fā)展的聯(lián)系尚未見報道。本研究

5、主要探究miRNA-3568與動脈粥樣硬化尤其是對平滑肌細胞的作用及其相關機制，以期為干預AS的發(fā)生、發(fā)展及醫(yī)治提供新的思路。
　　方法：
　　1.利用瞬時轉染技術將miR-3568在大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞(A7r5)抑制和過表達。
　　2.運用實時定量PCR技術觀測A7r5細胞中miR-3568在PDGF-BB刺激下表達量的變化。
　　3. Western Blot法分析Akt、FoxO1、ERK蛋白表達的

6、變化。
　　4.采用MTT方法檢測miR-3568對A7r5細胞增殖的影響。
　　5.采用Boyden’s Chamber實驗觀察miR-3568對A7r5細胞遷移的影響。
　　6.采用Dual luciferase Report實驗驗證miR-3568的靶基因。
　　結果：
　　1.轉染Anti-miR-3568組能明顯抑制A7r5細胞中miR-3568的表達量。而轉染Pre-miR-3568能增加A7r

7、5細胞中miR-3568表達量。
　　2.實時定量PCR結果說明：在PDGF-BB刺激下，miR-3568在A7r5細胞中表達量降低。
　　3. Western Blot實驗結果表明：在 PDGF-BB刺激下，轉染 Anti-miR-3568對A7r5細胞的p-Akt、p-ERK和p-FoxO1表達量有上調作用。
　　4. MTT實驗表明：Anti-miR-3568具有促進A7r5細胞增殖的作用。加入PI3K的抑制劑(

8、BEZ-235)后，細胞增殖作用受到抑制。但Pre-miR-3568對A7r5細胞的增殖沒有明顯的影響。
　　5. Boyden’s Chamber實驗表明：Anti-miR-3568具有促進A7r5細胞遷移的作用。BEZ-235處理細胞后，細胞的遷移作用被抑制。但Pre-miR-3568對A7r5細胞遷移無明顯影響。
　　6. Dual luciferase Report實驗結果顯示：miR-3568與FoxO1沒有明顯的