芳香化酶P450在子宮腺肌病及子宮內(nèi)膜異位癥中的表達(dá)及意義.pdf

1、研究目的：通過(guò)對(duì)在位、異位子宮內(nèi)膜芳香化酶P450的檢測(cè)，探討其在子宮腺肌病及子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病中的作用和用于診斷子宮腺肌病及子宮內(nèi)膜異位癥的價(jià)值。 材料和方法：1.研究對(duì)象：選擇2003年1月～2005年2月在我院婦科行全子宮切除術(shù)，及單或雙卵巢巧克力囊腫切除術(shù)(術(shù)畢刮取子宮內(nèi)膜)，選擇病理確診為子宮腺肌病為研究組Ⅰ(80例)，選擇子宮內(nèi)膜異位癥的患者為研究組Ⅱ(40例)，同時(shí)選擇同期因?qū)m頸原位癌手術(shù)的非子宮內(nèi)膜異位癥患者為對(duì)

2、照組(30例)。研究組Ⅰ年齡26～54(40.93±6.61)歲，研究組Ⅱ年齡30～53(42.63±6.34)歲，對(duì)照組年齡為28～51(42.23±7.03)歲，月經(jīng)周期規(guī)律，無(wú)內(nèi)科合并癥。所有患者術(shù)前3個(gè)月均未采用激素類藥物治療。采用修訂后美國(guó)生育協(xié)會(huì)(AFS)子宮內(nèi)膜異位癥評(píng)分法(rAFS)對(duì)研究組Ⅱ進(jìn)行臨床分期。 2.標(biāo)本采集：術(shù)時(shí)取患者異位病灶和在位子宮內(nèi)膜及對(duì)照組子宮內(nèi)膜。在位內(nèi)膜、正常內(nèi)膜均取自宮底部，異位內(nèi)膜取

3、自子宮腺肌病肌層(肌層內(nèi)見(jiàn)子宮內(nèi)膜腺體和/或間質(zhì)的部分)或卵巢巧克力囊腫內(nèi)壁。所取組織均經(jīng)病理檢驗(yàn)所證實(shí)。所取組織經(jīng)10％甲醛固定，石蠟包埋，進(jìn)行HE染色并在顯微鏡下觀察子宮內(nèi)膜組織病理形態(tài)，明確診斷。研究組Ⅰ取得異位子宮內(nèi)膜80例，在位子宮內(nèi)膜80例，其中增生期59例，分泌期21例；研究組Ⅱ其中Ⅰ～Ⅱ期13例，Ⅰ～Ⅳ期27例，取得異位子宮內(nèi)膜40例，在位子宮內(nèi)膜40例，其中增生期28例，分泌期12例。對(duì)照組中30例患者的子宮內(nèi)膜，其中

4、增生期20例，分泌期10例。 3.芳香化酶P450半定量檢測(cè)：3.1實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備防脫玻片、載玻片、鑷子、計(jì)時(shí)鐘、濕盒、吸管、微波爐等石蠟切片機(jī)：德國(guó)徠卡SM2000R滑動(dòng)式切片機(jī) 觀察和照相顯微鏡：日本OLYMPUSBX50型 數(shù)碼照相機(jī)：日本Nikon型號(hào)4500500萬(wàn)像素 (以上儀器均由中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科提供)3.2試劑第一抗體：鼠抗人細(xì)胞色素芳香化酶P450單抗(濃縮型)購(gòu)于英國(guó)Serot

5、ec公司。 LSAB試劑盒，編號(hào)K067311，購(gòu)于丹麥DAKO公司。 試劑盒含有3％H2O2，第二抗體：生物素化的抗兔/鼠免疫球蛋白，第三抗體：辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鏈親和素(Streptavidin)，DAB顯色劑和DAB稀釋液。PBS洗為0.01mol/L磷酸鹽緩沖液pH7.4。 4％甲醛、蒸餾水、蘇木素、枸櫞酸緩沖液(0.01mol/L,pH6.0)(由中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科提供) 3

6、.3免疫組化方法(LSAB法，試劑盒為DAKO公司產(chǎn)品)3.3.1配備1：50、1：100、1：200的鼠抗人細(xì)胞色素P450芳香化酶稀釋液，以胎盤組織為陽(yáng)性對(duì)照，尋求最佳工作濃度。PBS代替Ⅰ抗作陰性對(duì)照 3.3.2石蠟切片脫蠟至水，蒸溜水洗1-2分鐘。 3.3.3用枸櫞酸緩沖液進(jìn)行微波熱修復(fù)10分鐘，自然冷卻，蒸溜水洗1-2分鐘。 3.3.43％H2O215分鐘，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，蒸溜水洗1-2分鐘，PB

7、S洗1-2分鐘。 3.3.5滴加一抗(P450單抗1：50)孵育4℃，24小時(shí)，PBS洗3次，每次5分鐘。 3.3.6滴加二抗孵育30分鐘，室溫，PBS洗3次，每次5分鐘。 3.3.7滴加三抗孵育30分鐘，室溫，PBS洗3次，每次5分鐘。 3.3.8DAB顯色，自來(lái)水沖洗10分鐘。 3.3.9Mayer's蘇木素復(fù)染細(xì)胞核2分鐘，自來(lái)水沖洗15分鐘。 3.3.10常規(guī)脫水透明，中性樹(shù)膠封片

8、。 3.4結(jié)果判定在高倍顯微鏡下(10×40)觀察細(xì)胞著色，P450arom陽(yáng)性細(xì)胞胞漿或胞膜染為棕黃色；陽(yáng)性結(jié)果判定：陽(yáng)性染色為細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕色顆粒，按染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)判定：陽(yáng)性染色為棕黃色顆粒，定位于細(xì)胞漿中，觀察染色切片中10個(gè)具有代表意義的高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取平均數(shù)作為結(jié)果。其中陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)＜25％為(+)，25％～50％為(++)，＞50％為(+++)，無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為(-)。

9、 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件包行數(shù)據(jù)分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：方差分析、χ2檢驗(yàn)和四格表精確概率法。 結(jié)果1.不同月經(jīng)周期在位子宮內(nèi)膜組織芳香化酶P450的表達(dá)：研究組Ⅰ在位內(nèi)膜組織中，增生期和分泌期的陽(yáng)性表達(dá)率分別為81.4％和81.0％，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；研究組Ⅱ在位內(nèi)膜組織中，增生期和分泌期的陽(yáng)性表達(dá)率分別為78.6％和75.0％，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；對(duì)照組在位內(nèi)膜組織中，增生期和

10、分泌期的陽(yáng)性表達(dá)率分別為0和0，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；研究組Ⅰ與研究組Ⅱ在位內(nèi)膜組織中增生期和分泌期的陽(yáng)性表達(dá)率分別為81.4％、81.0％和78.6％、75.0％，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；研究組Ⅰ與與對(duì)照組在位內(nèi)膜組織中，增生期和分泌期的陽(yáng)性表達(dá)率分別為81.4％、81.0％和0、0，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；研究組Ⅱ與對(duì)照組在位內(nèi)膜組織中，增生期和分泌期的陽(yáng)性表達(dá)率分別為78.6％、75.0％和0、0，

11、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 2.不同月經(jīng)周期異位子宮內(nèi)膜組織芳香化酶P450的表達(dá)：研究組Ⅰ異位內(nèi)膜組織中，增生期和分泌期的陽(yáng)性表達(dá)率分別為89.8％和85.7％，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；研究組Ⅱ異位內(nèi)膜組織中，增生期和分泌期的陽(yáng)性表達(dá)率分別為85.7％和83.3％，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；研究組Ⅰ與研究組Ⅱ異位內(nèi)膜組織中增生期和分泌期的陽(yáng)性表達(dá)率分別為89.8％、85.7％和85.7％、83.3％，

12、差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 3.不同期別子宮內(nèi)膜異位癥在位子宮內(nèi)膜組織中芳香化酶P450的表達(dá)：Ⅰ～Ⅱ期與Ⅲ～Ⅳ期子宮內(nèi)膜異位癥患者在位內(nèi)膜組織中表達(dá)陽(yáng)性率分別為76.9％和77.8％，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜芳香化酶P450的表達(dá)與rAFS分期無(wú)相關(guān)性，r=0.176。 4.不同期別子宮內(nèi)膜異位癥異位子宮內(nèi)膜組織中芳香化酶P450的表達(dá)：Ⅰ～Ⅱ期與Ⅲ～Ⅳ期子宮內(nèi)膜異位癥患者異位內(nèi)

13、膜組織中表達(dá)陽(yáng)性率分別為84.6％和85.2％，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。子宮內(nèi)膜異位癥異位內(nèi)膜芳香化酶P450的表達(dá)與rAFS分期無(wú)相關(guān)性，r=0.007。 5.檢測(cè)子宮內(nèi)膜芳香化酶P450診斷子宮腺肌病及子宮內(nèi)膜異位癥檢測(cè)子宮內(nèi)膜芳香化酶P450診斷子宮腺肌病及子宮內(nèi)膜異位癥敏感度81.3％和77.5％，特異度100％和100％，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值100％和100％，陰性預(yù)測(cè)值66.7％和76.9％。 結(jié)論：1.正常

14、子宮內(nèi)膜的芳香化酶P450的表達(dá)呈陰性。 2.子宮腺肌病及子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜的芳香化酶P450的表達(dá)呈陽(yáng)性，且增生期與分泌期表達(dá)無(wú)差異。提示芳香化酶P450的異常表達(dá)可導(dǎo)致局部雌激素合成增加，促進(jìn)具有生長(zhǎng)功能的子宮內(nèi)膜在異位病灶生長(zhǎng)，最終導(dǎo)致子宮腺肌病與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生。 3.子宮內(nèi)膜異位癥患者在位、異位內(nèi)膜中芳香化酶P450表達(dá)明顯高于對(duì)照組的子宮內(nèi)膜，但其陽(yáng)性表達(dá)沒(méi)有隨病情加重而上升，這提示芳香化酶

15、P450在子宮內(nèi)膜異位癥的表達(dá)與rAFS分期無(wú)相關(guān)性，其表達(dá)代表異位病灶的活性，與子宮內(nèi)膜異位癥嚴(yán)重程度無(wú)相關(guān)關(guān)系。 4.根據(jù)芳香化酶P450在子宮腺肌病及子宮內(nèi)膜異位癥中表達(dá)呈陽(yáng)性，可作為子宮腺肌病與子宮內(nèi)膜異位癥的一種診斷方法應(yīng)用于臨床。檢測(cè)子宮內(nèi)膜芳香化酶P450診斷子宮腺肌病及子宮內(nèi)膜異位癥敏感度81.3％和77.5％，特異度100％和100％，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值100％和100％，陰性預(yù)測(cè)值66.7％和76.9％，有較高的診斷