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文檔簡(jiǎn)介
1、SIV感染恒河猴(SIV/恒河猴模型)是目前艾滋病研究應(yīng)用最廣泛的非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型,而SHIV感染恒河猴(SHIV/恒河猴模型)是目前國(guó)內(nèi)外艾滋病模型研究的趨勢(shì),被認(rèn)為是比SIV/恒河猴模型針對(duì)性更強(qiáng)、更有意義的動(dòng)物模型。在現(xiàn)階段尚未找到最適合動(dòng)物模型的情況下,本課題同時(shí)就這兩個(gè)非人靈長(zhǎng)類艾滋病動(dòng)物模型進(jìn)行研究,一方面,在中國(guó)恒河猴體內(nèi)滴定SHIV-KB9病毒,擬建立SHIV/中國(guó)恒河猴模型。另一方面,使用ELISPOT方法測(cè)定SIV
2、/恒河猴模型的細(xì)胞免疫情況,進(jìn)一步完善此模型。 目前國(guó)內(nèi)尚未構(gòu)建出理想的SHIV病毒株,為了盡早成功建立SHIV感染動(dòng)物模型,以國(guó)外構(gòu)建的SHIV-KB9病毒接種中國(guó)恒河猴,進(jìn)行了包括臨床表現(xiàn)、病原學(xué)、病毒學(xué)和免疫學(xué)等方面研究。為了進(jìn)一步確證SHIV-KB9感染中國(guó)恒河猴的病毒濃度范圍,測(cè)試動(dòng)物對(duì)病毒的適應(yīng)性,明確動(dòng)物模型的可重復(fù)性,我們接著進(jìn)行第二批動(dòng)物實(shí)驗(yàn),以期獲得一個(gè)穩(wěn)定而明確的SHIV-KB9病毒感染濃度范圍。
3、本研究共選用了10只中國(guó)恒河猴,實(shí)驗(yàn)前經(jīng)血清學(xué)和PCR證明無(wú)SIV、STLV-1、SRV/D和B病毒感染。第一批實(shí)驗(yàn)猴6只,6只恒河猴分別靜脈注射lmL稀釋好的病毒液。A0417注射病毒濃度為4.8x10<'8>copies/mL的病毒原液1mL,A0418-A0422分別注射10<'-1>-10<'-5>。病毒液1mL。定期采集肝素和EDTA抗凝血液標(biāo)本,分別進(jìn)行病毒分離、外周血前病毒DNA、血漿病毒載量、CD4<'+>/CD8<'+
4、.比值及血漿P27抗原等指標(biāo)的測(cè)定,以監(jiān)測(cè)SHIV-KB9病毒在恒河猴體內(nèi)復(fù)制和感染猴的免疫反應(yīng)情況。結(jié)果表明,感染病毒濃度為4.8x 10<'6>copies/mL及以上的SHIV-KB9病毒液可有效的感染中國(guó)恒河猴,此實(shí)驗(yàn)中感染病毒濃度高的3只恒河猴(A0417-A0419)被感染上SHIV-KB9。 在第一批實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,我們進(jìn)行了第二批感染濃度確認(rèn)實(shí)驗(yàn),第二批實(shí)驗(yàn)使用了中國(guó)恒河猴4只。病毒液稀釋及感染方法同上。A0423
5、-A0426分別注射10<'-1>-10<'-4>病毒液1mL。檢測(cè)指標(biāo)同上。結(jié)果證實(shí),感染病毒濃度為4.8×10<'5>copies/mL及以上的SHIV-KB9病毒液可有效的感染中國(guó)恒河猴,此實(shí)驗(yàn)中感染病毒濃度高的3只恒河猴(A0423-A0425)被感染上SHIV-KB9。 兩次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SHIV-KB9病毒能感染中國(guó)恒河猴,4.8×10<'5>copies/mL及以上濃度的SHIV-KB9病毒液能成功感染中國(guó)恒河猴。在
6、感染后的實(shí)驗(yàn)猴體內(nèi),血漿病毒載量、外周血前病毒水平和免疫反應(yīng)三者之間是正相關(guān)的。到目前為止,A419(10<'-2>)和A425(10<'-3>)出現(xiàn)了CD4<'+>T細(xì)胞嚴(yán)重衰竭的現(xiàn)象。A425(10<'-3>)出現(xiàn)艾滋病臨床癥狀,其余8只實(shí)驗(yàn)猴尚未觀察到明顯的艾滋病癥狀。 另一方面,如何系統(tǒng)合理的評(píng)價(jià)疫苗或病毒引起的免疫應(yīng)答反應(yīng)是AIDS疫苗研究中的另外一個(gè)重點(diǎn)。在現(xiàn)有的SHlV/恒河猴模型還在研究的同時(shí),為了完善現(xiàn)有的SI
7、V/恒河猴模型,掌握恒河猴被SIV感染后體內(nèi)細(xì)胞免疫應(yīng)答狀態(tài),為評(píng)價(jià)HIV疫苗提供方法和數(shù)據(jù)上的參考,我們測(cè)定了SIV感染猴體內(nèi)病毒特異性的細(xì)胞免疫水平。從現(xiàn)在國(guó)外常用的單細(xì)胞功能測(cè)定方法,如MHC-多肽四聚體染色法、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色法和酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法等方法中,我們選擇了經(jīng)濟(jì)實(shí)用的ELISPOrr方法,從而了解SIV誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答與病毒復(fù)制情況、猴體自身的免疫狀況之間的關(guān)系。 在此研究中,我們使用了4只中國(guó)恒河猴。后肢靜脈感染
8、SIVmac239,定期采集EDTA抗凝血液標(biāo)本,分別進(jìn)行血漿病毒載量、CD4<'+>T細(xì)胞絕對(duì)數(shù)等指標(biāo)的測(cè)定及IFN-уELISPOT測(cè)定斑點(diǎn)形成細(xì)胞(SFC),以監(jiān)測(cè)SIVmac239病毒在恒河猴體內(nèi)復(fù)制情況、感染猴細(xì)胞免疫情況及其之間的關(guān)系。 結(jié)果顯示IFN-уELISPOT方法能有效的評(píng)估實(shí)驗(yàn)猴的細(xì)胞免疫情況,明確了SIvmac239感染中國(guó)恒河猴體內(nèi)CTL的基本趨勢(shì)和范圍,了解了外周血病毒載量、外周免疫損傷與細(xì)胞免疫狀
9、況之間的聯(lián)系,完善了SIV/SAIDS模型評(píng)價(jià)指標(biāo),為使用此模型評(píng)價(jià)抗病毒藥-物或疫苗提供了基礎(chǔ)條件。 本研究首次成功的進(jìn)行了SHIV-KB9感染中國(guó)恒河猴的實(shí)驗(yàn)研究,確定SHIV-KB9能有效的感染中國(guó)恒河猴,并明確了SHIV-KB9感染中國(guó)恒河猴的有效病毒濃度范圍,確定了SHIV-KB9病毒感染中國(guó)恒河猴的病毒學(xué)、免疫學(xué)的測(cè)定指標(biāo),成功的建立了SHIV-KB9/中國(guó)恒河猴動(dòng)物模型。同時(shí)進(jìn)行了SIV/恒河猴的細(xì)胞免疫應(yīng)答的測(cè)定
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