SIV-SHIV-SAIDS動物模型的實驗研究.pdf

1、SIV感染恒河猴(SIV/恒河猴模型)是目前艾滋病研究應(yīng)用最廣泛的非人靈長類動物模型，而SHIV感染恒河猴(SHIV/恒河猴模型)是目前國內(nèi)外艾滋病模型研究的趨勢，被認(rèn)為是比SIV/恒河猴模型針對性更強、更有意義的動物模型。在現(xiàn)階段尚未找到最適合動物模型的情況下，本課題同時就這兩個非人靈長類艾滋病動物模型進(jìn)行研究，一方面，在中國恒河猴體內(nèi)滴定SHIV-KB9病毒，擬建立SHIV/中國恒河猴模型。另一方面，使用ELISPOT方法測定SIV

2、/恒河猴模型的細(xì)胞免疫情況，進(jìn)一步完善此模型。 目前國內(nèi)尚未構(gòu)建出理想的SHIV病毒株，為了盡早成功建立SHIV感染動物模型，以國外構(gòu)建的SHIV-KB9病毒接種中國恒河猴，進(jìn)行了包括臨床表現(xiàn)、病原學(xué)、病毒學(xué)和免疫學(xué)等方面研究。為了進(jìn)一步確證SHIV-KB9感染中國恒河猴的病毒濃度范圍，測試動物對病毒的適應(yīng)性，明確動物模型的可重復(fù)性，我們接著進(jìn)行第二批動物實驗，以期獲得一個穩(wěn)定而明確的SHIV-KB9病毒感染濃度范圍。

3、本研究共選用了10只中國恒河猴，實驗前經(jīng)血清學(xué)和PCR證明無SIV、STLV-1、SRV/D和B病毒感染。第一批實驗猴6只，6只恒河猴分別靜脈注射lmL稀釋好的病毒液。A0417注射病毒濃度為4.8x10<'8>copies/mL的病毒原液1mL，A0418-A0422分別注射10<'-1>-10<'-5>。病毒液1mL。定期采集肝素和EDTA抗凝血液標(biāo)本，分別進(jìn)行病毒分離、外周血前病毒DNA、血漿病毒載量、CD4<'+>/CD8<'+

4、.比值及血漿P27抗原等指標(biāo)的測定，以監(jiān)測SHIV-KB9病毒在恒河猴體內(nèi)復(fù)制和感染猴的免疫反應(yīng)情況。結(jié)果表明，感染病毒濃度為4.8x 10<'6>copies/mL及以上的SHIV-KB9病毒液可有效的感染中國恒河猴，此實驗中感染病毒濃度高的3只恒河猴(A0417-A0419)被感染上SHIV-KB9。 在第一批實驗的基礎(chǔ)上，我們進(jìn)行了第二批感染濃度確認(rèn)實驗，第二批實驗使用了中國恒河猴4只。病毒液稀釋及感染方法同上。A0423

5、-A0426分別注射10<'-1>-10<'-4>病毒液1mL。檢測指標(biāo)同上。結(jié)果證實，感染病毒濃度為4.8×10<'5>copies/mL及以上的SHIV-KB9病毒液可有效的感染中國恒河猴，此實驗中感染病毒濃度高的3只恒河猴(A0423-A0425)被感染上SHIV-KB9。 兩次實驗結(jié)果顯示SHIV-KB9病毒能感染中國恒河猴，4.8×10<'5>copies/mL及以上濃度的SHIV-KB9病毒液能成功感染中國恒河猴。在

6、感染后的實驗猴體內(nèi)，血漿病毒載量、外周血前病毒水平和免疫反應(yīng)三者之間是正相關(guān)的。到目前為止，A419(10<'-2>)和A425(10<'-3>)出現(xiàn)了CD4<'+>T細(xì)胞嚴(yán)重衰竭的現(xiàn)象。A425(10<'-3>)出現(xiàn)艾滋病臨床癥狀，其余8只實驗猴尚未觀察到明顯的艾滋病癥狀。 另一方面，如何系統(tǒng)合理的評價疫苗或病毒引起的免疫應(yīng)答反應(yīng)是AIDS疫苗研究中的另外一個重點。在現(xiàn)有的SHlV/恒河猴模型還在研究的同時，為了完善現(xiàn)有的SI

7、V/恒河猴模型，掌握恒河猴被SIV感染后體內(nèi)細(xì)胞免疫應(yīng)答狀態(tài)，為評價HIV疫苗提供方法和數(shù)據(jù)上的參考，我們測定了SIV感染猴體內(nèi)病毒特異性的細(xì)胞免疫水平。從現(xiàn)在國外常用的單細(xì)胞功能測定方法，如MHC-多肽四聚體染色法、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色法和酶聯(lián)免疫斑點法等方法中，我們選擇了經(jīng)濟(jì)實用的ELISPOrr方法，從而了解SIV誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答與病毒復(fù)制情況、猴體自身的免疫狀況之間的關(guān)系。 在此研究中，我們使用了4只中國恒河猴。后肢靜脈感染

8、SIVmac239，定期采集EDTA抗凝血液標(biāo)本，分別進(jìn)行血漿病毒載量、CD4<'+>T細(xì)胞絕對數(shù)等指標(biāo)的測定及IFN-уELISPOT測定斑點形成細(xì)胞(SFC)，以監(jiān)測SIVmac239病毒在恒河猴體內(nèi)復(fù)制情況、感染猴細(xì)胞免疫情況及其之間的關(guān)系。 結(jié)果顯示IFN-уELISPOT方法能有效的評估實驗猴的細(xì)胞免疫情況，明確了SIvmac239感染中國恒河猴體內(nèi)CTL的基本趨勢和范圍，了解了外周血病毒載量、外周免疫損傷與細(xì)胞免疫狀

9、況之間的聯(lián)系，完善了SIV/SAIDS模型評價指標(biāo)，為使用此模型評價抗病毒藥-物或疫苗提供了基礎(chǔ)條件。 本研究首次成功的進(jìn)行了SHIV-KB9感染中國恒河猴的實驗研究，確定SHIV-KB9能有效的感染中國恒河猴，并明確了SHIV-KB9感染中國恒河猴的有效病毒濃度范圍，確定了SHIV-KB9病毒感染中國恒河猴的病毒學(xué)、免疫學(xué)的測定指標(biāo)，成功的建立了SHIV-KB9/中國恒河猴動物模型。同時進(jìn)行了SIV/恒河猴的細(xì)胞免疫應(yīng)答的測定