獼猴桃軟腐病病原學(xué)研究.pdf

1、四川是獼猴桃種植大省，種植歷史悠久，2011年年產(chǎn)量約為13萬噸。獼猴桃軟腐病是貯藏期危害最為嚴重的病害，發(fā)病迅速且難于防治。有關(guān)獼猴桃軟腐病的研究尚處于初始階段，其病原種類、致病機制和發(fā)病果實的生理物質(zhì)變化等報道甚少。基于以上原因，本論文對該病病原物進行了系統(tǒng)研究并獲得以下結(jié)果:
　　從四川省蒼溪、都江堰、名山、彭州、邛崍和雙流等地的發(fā)病獼猴桃果實上共分離到135株Botryosphaeriaceae科真菌。根據(jù)病原菌的形態(tài)特征

2、以及內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internaltranscribed space，ITS)、翻譯延長因子(transcription elongation factor1-α，TEF)和β-微管蛋白(β-tubulin，BT)序列將病原菌鑒定為Botryosphaeria dothidea、Lasiodiplodiatheobromae和Neofusicoccum parvum其中L.theobromae和N.parvum是第一次報道為該病的病原物

3、。研究也發(fā)現(xiàn)B.dothidea能以分生孢子器和假囊殼越冬，越冬的分生孢子和子囊孢子與從果實上分離的3種病原菌（B.dothidea、L.theobromae和N.parvum）一樣，均能危害果實、葉片和枝條，表明越冬的B.dothidea分生孢子和子囊孢子為獼猴桃軟腐病的初侵染源。病原菌生物學(xué)特性研究結(jié)果表明，3種病原菌（Botryosphaeriadothidea、Lasiodiplodia theobromae和Neofusico

4、ccum parvum）的菌絲生長和孢子萌發(fā)的最適溫度為25～30℃。菌絲生長最適pH值為5～8，而孢子萌發(fā)最適pH值為6～8。不同病原菌對碳源和氮源的利用程度不盡相同。Neofusicoccum parvum的最適碳源是木糖， Botryosphaeria dothidea和Lasiodiplodia theobromae的最適碳源為葡萄糖。氮源利用試驗表明，NH4Cl為N.parvum和B.dothidea的最適氮源，而L.theo

5、bromae的最適氮源為谷氨酸。
　　對37株Botryosphaeria dothidea，2株Lasiodiplodia theobromae和13株Neofusicoccum parvum，共52株分離物進行致病力測定和遺傳多樣性分析。結(jié)果表明它們均能造成果實發(fā)病，但致病力有明顯差異。對于B.dothidea種類來說，弱致病力菌株占29.73％（11株），中致病力菌株占43.24％（16株），強致病力菌株占27.03％(10

6、株)。同樣，中致病力菌株在N.parvum類群中所占比例也最高(53.85％)，弱致病力菌株占7.69％（1株），強致病力菌株占38.46％（5株）。2株L.theobromae均為強致病力菌株。利用簡單重復(fù)序列區(qū)間擴增多態(tài)性標記(inter-simple sequence repeats，ISSR)和相關(guān)序列擴增多態(tài)性標記（Sequence Related Amplified Polymorphism，SRAP）分析這52株病原菌的多

7、樣性。9個ISSR引物共擴增出128條譜帶，其中多態(tài)性條帶為86條，占總條帶數(shù)的67.19％，每對引物平均獲得9.56條。8對SRAP引物組合共擴增出114條譜帶，其中多態(tài)性條帶為78條，占總條帶數(shù)的68.42％，每對引物平均獲得9.75條。在遺傳距離約0.645處，9個ISSR分子標記可將獼猴桃軟腐病菌劃分為3個大類:類群Ⅰ所有菌株為B.dothidea（37個菌株）;類群Ⅱ所有菌株均為N.parvum（括13個菌株）;而類群Ⅲ只有2

8、個菌株，它們均為L.theobromae。在0.798處類群Ⅰ分為5個組。在0.708處類群Ⅱ分為3個組。在0.996處類群Ⅲ各分為兩個菌株，均為L.theobromae。8對SRAP分子標記在遺傳距離約0.608處，可將獼猴桃軟腐病菌劃分為2個大類:類群Ⅰ所有菌株為B.dothidea（37個菌株）;類群Ⅱ包括13個N.parvum菌株和2個L.theobromae菌株。在0.779處類群Ⅰ分為7個組，在0.77處類群Ⅱ分為6個組，其

9、中1至5個組均由N.parvum菌株構(gòu)成，第6個組由兩株L.theobromae菌株構(gòu)成。綜合結(jié)果表明，來源于四川省6個地區(qū)的獼猴桃軟腐病菌的遺傳多樣性與致病性強弱及地理來源并無明顯相關(guān)關(guān)系。
　　對獼猴桃軟腐菌致病因子研究結(jié)果表明，B.dothidea能在PDA、Fries與Czapek培養(yǎng)液中產(chǎn)生毒素，但在Fries與Czapek培養(yǎng)液中產(chǎn)生的毒素活性更強。在光暗交替振蕩條件下病原菌產(chǎn)生的毒素活性明顯強于黑暗振蕩培養(yǎng)中產(chǎn)生的毒

10、素活性。利用丙酮提取的毒素活性高于用甲醇+氯仿提取的活性。致病性測定結(jié)果表明，B.dothidea、Lasiodiplodia theobromae和Neofusicoccum parvum產(chǎn)生的毒素、果膠酶及纖維素酶能對獼猴桃果實和葉片產(chǎn)生傷害。
　　根據(jù)Neofusicoccum parvum的目的纖維素酶基因和看家基因序列，設(shè)計了ubiquitinconjugating enzyme(ubcB)、Beta-tubulin(β

11、-tub)和RNA polymerase iii transcription factor(TFC1)3個看家基因的特異性引物，和6對跨內(nèi)含子和1對不跨內(nèi)含子（基因無內(nèi)含子）的纖維素酶基因的特異性引物。結(jié)果表明，由這3個看家基因作為參照分別計算出來的7個纖維素酶基因的表達量趨勢高度一致，但是由TFC1作為參照計算出來的7個纖維素酶基因表達量均高于其它兩個看家基因作為參照時的表達量。在6d的侵染過程中，UCRNP2_2427和UCRNP2

12、_7122纖維素酶基因的表達量為先下降后上升再下降又再上升的W型趨勢，UCRNP2_2356、UCRNP2_5067和UCRNP2_7847纖維素酶基因的表達量趨勢為先下降后上升，呈U型趨勢， UCRNP2_3883的表達量趨勢為先上升后下降的倒Ⅴ型，而UCRNP2_8897的表達量趨勢則為先下降再上升然后再下降。對于7個基因來說，UCRNP2_2427基因的表達量在第1d最低，而UCRNP22356最高;UCRNP2_5067的表達量

13、在第2、3和4d最低，而UCRNP23883表達量在第2d最高，但是UCRNP2_2356在第3和4d最高;UCRNP2_2427和UCRNP2_5067在第5d表達量一樣，均為最低，而在同一天UCRNP2_2356的表達量最高;在第6d時，UCRNP2_2356表達量最高，而UCRNP2_3883表達量最低。
　　根據(jù)B.dothidea的ITS序列設(shè)計了一對用于特異擴增該病原菌的引物BZY-1/BZY-2。除B.dothide

14、a能擴增出目標片段外，該對引物對參試的其它25屬真菌均不能擴增出相應(yīng)的條帶。該引物不僅能從接種B.dothidea的果實里擴增出特異性條帶，并且也能從自然發(fā)病的果實中擴增出B.dothidea特有的條帶，而健康果實則未有任何條帶。
　　對水楊酸和生防菌Lecythophora luteoviridis發(fā)酵液誘導(dǎo)獼猴桃抗軟腐病的研究結(jié)果表明，水楊酸和L.luteoviridis的無菌發(fā)酵液浸泡獼猴桃果實后，能使果實發(fā)病時間延遲。利用

15、水楊酸和L.luteoviridis發(fā)酵液誘導(dǎo)果實后，在6d內(nèi)連續(xù)測量獼猴桃果實超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)的變化結(jié)果表明，這5種物質(zhì)在不同處理中有不同的變化趨勢。但是大多數(shù)情況下接種病原菌的果實CAT、POD、SOD、 Pro和MDA含量均比不接種病原菌的高。蒸餾水浸泡果實后接種病原菌的果實CAT、POD、SOD、 Pro和MDA在大多數(shù)情況下均比其它處理的高