免疫內(nèi)酯LY267108抑制人工關(guān)節(jié)假體周圍骨溶解的基礎(chǔ)研究.pdf

1、人工關(guān)節(jié)置換術(shù)作為各類四肢關(guān)節(jié)終末期病變的終極治療手段，為患者提供了重建關(guān)節(jié)功能及重返社會活動的機(jī)會，獲得了良好的治療效果。隨著人工關(guān)節(jié)置換技術(shù)在全球范圍內(nèi)的廣泛普及，人工關(guān)節(jié)無菌性松動，作為影響人工關(guān)節(jié)假體使用壽命的最常見遠(yuǎn)期并發(fā)癥，已成為困擾廣大關(guān)節(jié)外科醫(yī)生和患者的難題。而如何防治人工關(guān)節(jié)無菌性松動，一直是關(guān)節(jié)外科醫(yī)生面臨的最大挑戰(zhàn)。
　　研究證明，磨損顆粒誘導(dǎo)的人工關(guān)節(jié)假體周圍骨溶解是人工關(guān)節(jié)無菌性松動的主要原因。在假體周圍

2、骨溶解的發(fā)生發(fā)展過程中，大量磨損顆粒產(chǎn)生后被假體周圍巨噬細(xì)胞吞噬，刺激巨噬細(xì)胞釋放IL-1、IL-6、TNF-α等炎癥因子；這些炎癥因子在趨化作用下假體周圍基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)RANKL mRNA異常增多，RANKL和OPG的平衡被打破，大量RANKL分子釋放，這些RANKL與破骨前體細(xì)胞表面的RANK結(jié)合，引發(fā)級聯(lián)細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)反應(yīng)，最終使本來呈結(jié)合狀態(tài)的核因子-κB（NF-κB）與κB抑制蛋白（IκB）發(fā)生解離，移入細(xì)胞核中與目的基因結(jié)合，

3、啟動目的基因轉(zhuǎn)錄，從而啟動破骨細(xì)胞分化激活，產(chǎn)生溶骨反應(yīng)。因此，防治人工關(guān)節(jié)無菌性松動的關(guān)鍵在于，找到一種方法，能夠在磨損顆粒誘導(dǎo)骨溶解的發(fā)生過程中的某個環(huán)節(jié)進(jìn)行阻斷，使得整個機(jī)制鏈無法向下進(jìn)行。
　　研究表明，紅霉素除了具有抗菌活性外，還具有胃動素樣作用及抗炎、免疫調(diào)節(jié)活性。而近來有研究表明，紅霉素尚對骨溶解亦具有一定的抑制作用，而這種作用與其抗炎活性存在一定關(guān)聯(lián)，關(guān)鍵機(jī)制在于紅霉素可以抑制NF-κB的活性。NF-κB不僅是炎癥

4、反應(yīng)的關(guān)鍵因子，也是破骨細(xì)胞活化的分子過程中的樞紐因子。然而考慮到抗生素得應(yīng)用原則，盡管紅霉素具有一定的骨溶解抑制作用，其抗菌活性卻限制了其防治假體周圍骨溶解的長期使用。
　　免疫內(nèi)酯是一類新型的紅霉素衍生物，其特點(diǎn)是消除了紅霉素的抗菌活性及胃動素樣作用，同時具有抗炎及免疫調(diào)節(jié)活性。然而免疫內(nèi)酯是否能像紅霉素一樣對磨損顆粒誘導(dǎo)的骨溶解具有抑制作用，目前未見相關(guān)研究報道。LY267108是免疫內(nèi)酯目前研究較多的一種藥物。本課題的研究

5、目的是研究免疫內(nèi)酯LY267108是否能夠通過抑制破骨前體細(xì)胞內(nèi)NF-κB的激活，達(dá)到抑制磨屑誘導(dǎo)骨溶解的生物學(xué)效應(yīng)。如果這種猜想成立，那么既有較強(qiáng)抑制骨溶解作用又沒有抗菌活性的免疫內(nèi)酯將極有可能成為預(yù)防人工關(guān)節(jié)假體周圍骨溶解的理想藥物。
　　本課題包括以下四個部分：
　　第一部分 免疫內(nèi)酯LY267108對破骨細(xì)胞活化的抑制作用和分子機(jī)制
　　目的：評價LY267108對破骨細(xì)胞活化的抑制作用和分子機(jī)制。
　　

6、方法：采用RANKL及M-CSF誘導(dǎo)鼠RAW264.7細(xì)胞，建立破骨細(xì)胞誘導(dǎo)模型。通過給予不同濃度的阿侖膦酸鈉、紅霉素、LY267108進(jìn)行干預(yù)后，通過破骨細(xì)胞TRAP染色觀察LY267108干預(yù)下破骨細(xì)胞分化激活的抑制作用并與阿侖膦酸鈉、紅霉素作比較；同時通過EMSA法及Western blot法分別檢測細(xì)胞核中NF-κB含量和細(xì)胞漿內(nèi)IκBα的水平，探討LY267108抑制破骨細(xì)胞活化的分子機(jī)制并與阿侖膦酸鈉、紅霉素作比較。

7、　　結(jié)果：TRAP染色結(jié)果顯示，單純誘導(dǎo)組鏡下可見多量多核破骨細(xì)胞，表明破骨細(xì)胞誘導(dǎo)模型建立成功。25mg/L濃度的LY267108干預(yù)組多核破骨細(xì)胞分化較其余各組少，提示較其他組具有更強(qiáng)的破骨細(xì)胞抑制作用。EMSA法及Western blot法結(jié)果表明，LY267108對NF-κB具有較強(qiáng)的抑制活性，10mg/LLY267108、25mg/L紅霉素與10mg/L阿侖膦酸鈉對NF-κB具有相似的抑制作用，且顯著強(qiáng)于10mg/L紅霉素，而

8、25mg/L LY267108具有最強(qiáng)的抑制作用。10 mg/L LY267108、25mg/L紅霉素與10mg/L阿侖膦酸鈉組中胞漿內(nèi)IκBα水平差異無顯著性意義，但顯著高于10mg/L紅霉素組，而25mg/L LY267108組胞漿內(nèi)IκBα水平最高。
　　結(jié)論：LY267108通過抑制NF-κB活性，對破骨細(xì)胞具有較紅霉素更強(qiáng)的抑制作用。而LY267108對IκBα降解的抑制作用，可能是其抑制NF-κB活化的機(jī)制之一。

9、>　　第二部分 載LY267108 PMMA骨水泥的生物力學(xué)性能研究
　　目的：評價不同質(zhì)量濃度下載LY267108骨水泥的疲勞強(qiáng)度及靜態(tài)機(jī)械性能。
　　方法：依據(jù)LY267108的質(zhì)量分?jǐn)?shù)不同及是否經(jīng)PBS溶液浸泡，分為非浸泡純骨水泥組（0.0％組）、0.1%組、0.5%組及1.0%組及浸泡純骨水泥組（0.0%組）、0.1%組、0.5%組及1.0%組共8組，每組根據(jù)不同測試的要求制備成相應(yīng)骨水泥試件。通過力學(xué)試驗(yàn)機(jī)對每組試

10、件進(jìn)行疲勞性能、彈性模量、抗拉強(qiáng)度、抗彎強(qiáng)度及抗壓強(qiáng)度的檢測，評價添加不同濃度的LY267108是否對骨水泥的力學(xué)形成產(chǎn)生影響。
　　結(jié)果：不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的LY267108骨水泥組與純骨水泥組相比，疲勞性能、彈性模量、抗彎強(qiáng)度均無顯著差異，1%組抗拉及抗壓強(qiáng)度則顯著高于其他各組（P<0.5）。相同濃度下，浸泡組與非浸泡組疲勞強(qiáng)度與機(jī)械性能無顯著差異。
　　結(jié)論：骨水泥中加入不超過1%的LY267108不會顯著改變骨水泥的疲勞性

11、能、彈性模量及抗彎強(qiáng)度。1%的LY267108顯著增強(qiáng)骨水泥的軸向強(qiáng)度（抗拉、抗壓）。骨水泥中加入不超過1%的LY267108后骨水泥力學(xué)性能符合臨床使用標(biāo)準(zhǔn)。
　　第三部分 載LY267108 PMMA骨水泥的洗提特性研究
　　目的：評價不同載荷量的LY267108骨水泥的洗提特性。
　　方法：把250、500、1000mg LY267108純粉分別加入40g骨水泥粉末中，根據(jù)在40g骨水泥粉末中LY267108加入

12、量不同，分別定為A、B、C組。通過浸提實(shí)驗(yàn)后，采用高效液相色譜儀串聯(lián)質(zhì)譜儀測定每個時點(diǎn)的每組浸提液的LY267108的濃度，計算出各組不同時點(diǎn)的LY267108釋放速率和釋放總量百分比。
　　結(jié)果：各組釋放速率均隨浸提時間延長而逐漸減小，減少的幅度先快后慢，大致分為快速釋放期(約第1-7d)、過渡期(快速釋放期后3-5d)和緩慢釋放期(約第10-12d后)。在同一時點(diǎn)，各組釋放速率隨著LY267108加入量的增加而逐漸增大，增大倍

13、數(shù)在快速釋放期與LY267108加入量增加倍數(shù)基本一致;而在緩慢釋放期均小于LY267108加入量的增加倍數(shù)。各組在快速釋放期釋放總量百分比相似，約11%，在168d時釋放總量百分比均＜25%。②在快速釋放期，各組的釋放總量百分比斜率較為一致，而在緩慢釋放期，釋放總量百分比斜率存在差別，即A組＞C組＞B組。
　　結(jié)論：不同載荷量的LY267108骨水泥的快速釋放期、過渡期、緩慢釋放期時間窗基本一致，LY267108載荷量越大，各期

14、釋放速率越大，但在快速釋放期LY267108釋放總量百分比基本相似，約為11%，而至168d時，各組釋放總量百分比均＜25%。
　　第四部分 載LY267108 PMMA骨水泥對磨屑誘導(dǎo)假體周圍骨溶解的抑制效應(yīng)
　　目的：評價載LY267108的骨水泥對磨屑誘導(dǎo)假體周圍骨溶解的抑制作用。
　　方法：通過向兔關(guān)節(jié)腔注射純鈦顆粒懸液建立人工關(guān)節(jié)無菌性松動模型，在兔股骨遠(yuǎn)端植入加入LY267108的骨水泥棒模擬臨床骨水泥型人

15、工關(guān)節(jié)置換術(shù)，通過骨組織切片改良麗春紅染色觀察假體周圍骨質(zhì)變化及假體骨界面的結(jié)合情況；用雙能 X線骨密度儀測量假體周圍骨密度，用萬能力學(xué)測試儀測定骨水泥-骨界面剪切力。
　　結(jié)果：純鈦顆粒作用下，載LY267108骨水泥與周圍骨小梁結(jié)合緊密，周圍骨質(zhì)較好；純骨水泥與周圍骨小梁結(jié)合較差，存在間隙，周圍骨質(zhì)較差。載LY267108骨水泥較純骨水泥周圍BMD增加36.9%（P<0.05），骨水泥-骨界面抗剪切力增加82.0%（P<0.0