淫羊藿甙對人工關(guān)節(jié)假體松動的作用及其分子機制.pdf

1、目的：分別從細胞水平、分子水平及動物實驗來探討淫羊藿甙對假體松動的防治作用及其機制。 方法：1細胞水平：(1)探討Ti微粒對體外培養(yǎng)的新生大鼠成骨細胞凋亡的影響及淫羊藿甙對其保護作用。取體外培養(yǎng)的大鼠成骨細胞，一組加入0.1％(體積比)的Ti微粒混懸液，另一組為淫羊藿甙共培養(yǎng)后的成骨細胞加0.1％(體積比)的Ti微?；旌吓囵B(yǎng)，并于培養(yǎng)后24小時后用流式細胞儀檢測成骨細胞的凋亡情況，透射電鏡觀察成骨細胞凋亡的超微結(jié)構(gòu)變化。Ti微粒

2、可誘導成骨細胞凋亡；用淫羊藿甙處理3天后的成骨細胞可部分對抗Ti微粒致細胞損傷作用。淫羊藿甙對Ti微粒誘導的成骨細胞凋亡具有部分保護作用。(2)觀察淫羊藿甙對關(guān)節(jié)磨屑刺激單核細胞分泌IL-1β、IL-6、PGE2、TNF的影響。分離培養(yǎng)兔外周血單核細胞，分成4組：D組：關(guān)節(jié)磨屑組，培養(yǎng)細胞中加入超高分子的聚乙烯顆粒(ultrahighmolecularweightpolyethylene,UHMWPE)。A組：D+10mg/ml的淫羊藿

3、甙。B組：D+1mg/ml的淫羊藿甙。C組：D+0.1mg/ml的淫羊藿甙。用放射免疫測定法測量各上清中PGE2及TNF含量。用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定各上清中IL-1β及IL-6含量。 2分子水平：研究淫羊藿甙對體外培養(yǎng)的大鼠成骨細胞OPNmRNA和Ⅰ型膠原表達的影響。從新生的SD大鼠的顱骨中，通過酶消化法分離出成骨細胞，放置于MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其形態(tài)通過倒置顯微鏡觀察，并通過ALP染色加以鑒定。成骨細胞采用24孔培養(yǎng)板，實驗分

4、四組進行，分別設(shè)為A，B，C，D，每組6孔。A，B，C組分別用終濃度為0.1mg/ml，1mg/ml，10mg/ml的淫羊藿甙注射液進行干預，均在第5d提取總RNA，進行RT-PCR擴增。D組用α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，不用藥物干預，于第5d提取總RNA，進行RT-PCR擴增。其對于成骨細胞增殖和分化的影響通過MTT比色實驗、BGP含量的放免法檢測以及用熒光二抗的免疫組化實驗測定Ⅰ型膠原的表達來進行；用RT-PCR技術(shù)分別檢測各組細胞的OP

5、NmRNA的表達并進行定量分析。 3動物實驗將30只成年新西蘭兔隨機分成三組。分陽性對照組、陰性對照組和用藥防治組，各10只，雌雄各半，手術(shù)方法行模擬膝關(guān)節(jié)假體置換，6周后陽性對照組和用藥防治組向膝關(guān)節(jié)注射鈦微粒懸液，陰性對照組注射生理鹽水。用藥防治組隔日注射淫羊藿甙1mg/膝，其余兩組不與任何藥物自由飲水攝食。16周后處死動物，取股骨下段作脫鈣切片，HE染色后光鏡下觀察假體周圍的病理變化；取膝關(guān)節(jié)囊研磨勻漿離心后測上清液中IL

6、-1β和TNF含量。股骨及脛骨連同植入物取出后，在相同條件下(片距70CM，暴光時間5S)攝取X線正位照片，選用脛骨側(cè)攝片輸入計算機圖象分析系統(tǒng)，定量分析脛骨側(cè)植入物周圍3MM厚度骨組織密度值[灰度值]，進行比較。 結(jié)果：1.(1)Ti微?？烧T導成骨細胞凋亡；用淫羊藿甙注射液處理3天后的成骨細胞可部分對抗Ti微粒致細胞損傷作用。(2)和D組比較，A、B、C三組各與假體松動相關(guān)細胞因子含量均明顯下降，且與藥物濃度呈負相關(guān)。2.淫羊

7、藿甙注射液對體外培養(yǎng)的大鼠成骨細胞OPNmRNA表達有明顯促進作用，其作用強度隨濃度而改變。3.和陰性對照組、用藥防治組比較，陽性對照組中檢測的IL-1β和TNF明顯增高，用藥防治組和陰性對比組比較無顯著差異，兩組脛骨灰度值無顯著差異。 結(jié)論：淫羊藿甙對Ti微粒誘導的成骨細胞凋亡具有部分保護作用。可以降低假體周圍炎性細胞因子的含量，促進成骨細胞基因表達，從而防治假體松動的產(chǎn)生。 第一部分淫羊藿甙注射液對Ti微粒誘導新生大

8、鼠顱骨成骨細胞凋亡的保護作用 目的探討Ti微粒對體外培養(yǎng)的新生大鼠成骨細胞凋亡的影響及淫羊藿甙注射液對其保護作用。方法取體外培養(yǎng)的新生大鼠成骨細胞，分別加入不同濃度的Ti微?；蛞蜣竭白⑸湟杭覶i微?；旌吓囵B(yǎng)，并于培養(yǎng)后24小時后用流式細胞儀檢測成骨細胞的凋亡情況，透射電鏡觀察成骨細胞凋亡的超微結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果Ti微?？烧T導成骨細胞凋亡，呈劑量依賴性；用淫羊藿甙注射液處理3天后的成骨細胞可部分對抗Ti微粒致細胞損傷作用。結(jié)論Ti微

9、粒可誘導成骨細胞凋亡，淫羊藿甙注射液對Ti微粒誘導的成骨細胞凋亡具有部分保護作用。 第二部分淫羊藿甙對誘導假體松動的骨吸收因子的影響 目的：觀察淫羊藿甙對關(guān)節(jié)磨屑刺激單核細胞分泌IL-1β、IL-6、PGE2、TNF的影響。方法：分離培養(yǎng)兔外周血單核細胞，分成4組：D組：關(guān)節(jié)磨屑組，培養(yǎng)細胞中加入超高分子的聚乙烯顆粒(ultrahighmolecularweightpolyethylene,UHMWPE)。A組：D+10

10、mg/ml的淫羊藿甙。B組：D+1mg/ml的淫羊藿甙。C組：D+0.1mg/ml的淫羊藿甙。用放射免疫測定法測量各上清中PGE2及TNF含量。用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定各上清中IL-1β及IL-6含量。結(jié)果：和D組比較，A、B、C三組各檢測指標均明顯下降，且與藥物濃度呈負相關(guān)。結(jié)論：淫羊藿甙可以降低假體周圍炎性細胞因子的含量，從而防治假體松動的產(chǎn)生。 第三部分淫羊藿甙對體外培養(yǎng)大鼠成骨細胞影響的實驗研究 目的：研究淫羊藿甙

11、對體外培養(yǎng)的大鼠成骨細胞功能的影響，探討淫羊藿甙促進成骨的細胞及分子機制。方法：實驗分組將不同濃度的淫羊藿甙加入到其中進行共培養(yǎng)，其對于成骨細胞增殖和分化的影響通過MTT比色實驗、BGP含量的放免法檢測以及用熒光二抗的免疫組化實驗測定Ⅰ型膠原酶的表達來進行；對硝基苯磷酸鹽法及茜素紅染色法觀察淫羊藿甙對體外培養(yǎng)成骨細胞的增殖、ALP表達的影響；用RT-PCR技術(shù)分別檢測各組細胞的OPNmRNA表達，并進行定量分析。結(jié)果：淫羊藿甙對成骨細胞

12、具有明顯的促增殖、分化及礦化作用；適當濃度的淫羊藿甙可以增強OPNmRNA和蛋白表達水平。結(jié)論：淫羊藿甙具有刺激體外培養(yǎng)成骨細胞增殖、分化和礦化的功能，它對成骨細胞中OPNmRNA和蛋白表達有明顯促進作用。 第四部分淫羊藿甙對Ti微粒誘導的實驗性假體松動的影響 目的：觀察淫羊藿甙對模型兔假體松動的防治作用，探討其防治機理。方法：將30只成年新西蘭兔隨機分成三組。分陽性對照組、陰性對照組和用藥防治組，各10只，雌雄各半，手

13、術(shù)方法行模擬膝關(guān)節(jié)假體置換，6周后陽性對照組和用藥防治組向膝關(guān)節(jié)注射鈦微粒懸液，陰性對照組注射生理鹽水。用藥防治組隔日膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射淫羊藿甙注射液，其余兩組不與任何藥物自由飲水攝食。16周后處死動物，取股骨下段作脫鈣切片，HE染色后光鏡下觀察假體周圍的病理變化；取膝關(guān)節(jié)囊研磨勻漿離心后測上清液中IL-1β和TNF含量。股骨及脛骨連同植入物取出后，在相同條件下(片距70CM，暴光時間5S)攝取X線正位照片，選用脛骨側(cè)攝片輸入計算機圖象分析系

14、統(tǒng)，定量分析脛骨側(cè)植入物周圍3mm厚度骨組織密度值[灰度值]，進行比較。結(jié)果：和陰性對照組、用藥防治組比較，陽性對照組中檢測的IL-1β和TNF明顯增高，用藥防治組和陰性對比組比較無顯著差異。結(jié)論：淫羊藿甙可以降低假體周圍炎性細胞因子的含量，從而防治假體松動的產(chǎn)生。 第五部分淫羊藿甙的制備工藝及質(zhì)量研究 目的：研究淫羊藿甙的制備工藝及質(zhì)量標準。方法采用大孔吸附樹脂柱層析分離和薄層色譜淫羊藿進行定性鑒別，采用薄層掃描法測定