組織工程化骨修復(fù)人工關(guān)節(jié)周?chē)侨睋p的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景： Branemark于20世紀(jì)60年代提出了骨整合的概念，即在光鏡水平下正常的改建骨和假體之間無(wú)軟組織，假體與骨組織直接接觸，其承受的負(fù)荷能通過(guò)直接接觸持續(xù)不斷地傳遞，并分散到骨組織中。骨整合被認(rèn)為是人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后的理想狀態(tài)。 生物固定性假體要獲得滿意的遠(yuǎn)期效果，依賴于假體骨組織間的緊密接觸、良好的骨長(zhǎng)入和一定的骨生長(zhǎng)時(shí)間。然而許多人工關(guān)節(jié)置換術(shù)或翻修術(shù)患者常合并有假體周?chē)侨睋p，為恢復(fù)骨性結(jié)構(gòu)并重建骨的穩(wěn)定

2、性，骨移植已成為修復(fù)骨缺損的一個(gè)必要手段。臨床上根據(jù)骨缺損的大小、性質(zhì)，可應(yīng)用自體骨移植、異體骨移植治療。但由于自體骨移植可提供的骨量有限，移植骨在形態(tài)、大小和數(shù)量上難以滿足缺損處的要求，特別是巨大的或特殊部位骨缺損的修復(fù)，故其應(yīng)用常常受到限制。1984年，Sloof等首先報(bào)告應(yīng)用異體顆粒骨代替自體骨，打壓植骨修復(fù)髖臼骨缺損。1993年，Ling等用同樣的技術(shù)行股骨骨缺損的修復(fù)重建，從此該項(xiàng)技術(shù)被廣泛的應(yīng)用于人工關(guān)節(jié)置換術(shù)及翻修術(shù)中。但

3、由于凍干的異體骨無(wú)成骨細(xì)胞，骨誘導(dǎo)活性低，新骨爬行替代及塑性的時(shí)間長(zhǎng)，有移植骨吸收、塌陷、假體松動(dòng)等并發(fā)癥的可能。 上世紀(jì)八十年代興起的骨組織工程學(xué)為骨缺損的修復(fù)提供了一個(gè)全新的思路和方法。組織工程涉及三個(gè)要素：即種子細(xì)胞、生物活性因子、支架材料。組織工程技術(shù)通過(guò)獲取具有成骨活性的組織，經(jīng)分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增，誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞，并在體外與可吸收的支架材料復(fù)合回植于體內(nèi)，依靠種子細(xì)胞的成骨作用及生物材料的降解吸收，最終形成骨組織。應(yīng)用組

4、織工程化骨修復(fù)長(zhǎng)骨節(jié)段性骨缺損、顱骨缺損已有較多的報(bào)告，而應(yīng)用組織工程化骨修復(fù)人工關(guān)節(jié)周?chē)侨睋p，并觀察其對(duì)假體骨界面骨整合的研究目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)告。 目的： 1.建立骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的分離、培養(yǎng)、骨向誘導(dǎo)方法； 2.體外骨髓MSCs與CHA(CHA)復(fù)合構(gòu)建組織工程化骨，觀察其修復(fù)植入體周?chē)少|(zhì)骨骨缺損的的效果。 3.觀察組織工程化骨修復(fù)植入體周?chē)侨睋p對(duì)植入體-骨界面骨整合的影響。

5、 4.研究BMP促進(jìn)組織工程化骨修復(fù)人工關(guān)節(jié)周?chē)侨睋p，提高假體-骨界面骨接觸的能力。 方法： 1.采用Ficoll(1.073g/ml)密度梯度離心加貼壁培養(yǎng)法分離兔骨髓MSCs，并培養(yǎng)、擴(kuò)增；將第4代骨髓MSCs應(yīng)用骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液(10-8mol/L地塞米松+10mmol/L甘油磷酸鈉+50mg/L維生素C)培養(yǎng)，骨向誘導(dǎo)。 2.誘導(dǎo)后的成骨細(xì)胞應(yīng)用細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞活力檢測(cè)、細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖曲線、ALP活性

6、檢測(cè)、礦化結(jié)節(jié)茜素紅染色、Ⅰ型膠原免疫組化與ALP鑒定。 3.于兔左側(cè)股骨髁制作-0.6×1.2cm的穿透性松質(zhì)骨骨缺損，植入鈦合金(Ti-6A1-4V)植入體于骨缺損的中央，在體外將同種異體骨髓MSCs與CHA復(fù)合構(gòu)建組織工程化骨，修復(fù)植入體周?chē)侨睋p，同法右側(cè)骨缺損處僅植入CHA為對(duì)照組，術(shù)后4、8、12周行X射線檢查、生物力學(xué)測(cè)試、放射性核素骨掃描、脫鈣骨組織學(xué)HE染色，觀察其骨缺損修復(fù)效果。 4.并于術(shù)后4、8、

7、12周行X射線檢查、剖面觀察、植入體剪切強(qiáng)度測(cè)定、植入體表面掃描電鏡、植入體骨界面能譜分析、不脫鈣骨組織學(xué)VanGieson苦味酸-品紅染色及圖像分析系統(tǒng)計(jì)算植入體骨接觸率，觀察組織工程化骨對(duì)植入體-骨界面骨整合的影響。 5.行犬人工全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)，制作股骨骨缺損模型，隨機(jī)分為三組，分別用rhBMP-2+自體骨髓MSCs+CHA、CHA+自體骨髓MSCs、CHA修復(fù)骨缺損，術(shù)后3個(gè)月處死動(dòng)物，行X射線檢查、生物力學(xué)測(cè)試、不脫鈣骨

8、組織學(xué)VanGicson苦味酸-品紅染色及圖像分析系統(tǒng)分析計(jì)算假體骨接觸率。 結(jié)果： 1.應(yīng)用密度梯度離心結(jié)合貼壁培養(yǎng)法成功的分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增兔骨髓MSCs，培養(yǎng)3天后細(xì)胞的形態(tài)由圓形轉(zhuǎn)為梭形；MSCs生長(zhǎng)曲線分為生長(zhǎng)潛伏期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和平臺(tái)期；MSCs表面標(biāo)志物SH3呈陽(yáng)性。 2.骨誘導(dǎo)后細(xì)胞培養(yǎng)5-8天，細(xì)胞形態(tài)逐漸變?yōu)槎嘟切?，呈現(xiàn)聚集生長(zhǎng)。誘導(dǎo)后細(xì)胞ALP活性較未誘導(dǎo)組顯著性增高。骨向誘導(dǎo)后第三代細(xì)胞ALP

9、染色、Ⅰ型膠原免疫組化染色均呈陽(yáng)性，茜素紅染色可見(jiàn)典型的礦化結(jié)節(jié)。 3.體外構(gòu)建組織工程化骨修復(fù)植入體周?chē)少|(zhì)骨缺損結(jié)果：術(shù)后4、8、12周大體觀察與剖面觀察，實(shí)驗(yàn)組隨時(shí)間的延長(zhǎng)可見(jiàn)骨修復(fù)。X線表現(xiàn)為CHA顆粒吸收，被新生骨取代。生物力學(xué)結(jié)果示術(shù)后12周股骨髁最大壓力載荷、載荷/應(yīng)變比值均較對(duì)照組高，最大應(yīng)變位移較對(duì)照組低(P＜0.01)。放射性核素骨掃描實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間點(diǎn)ROI平均計(jì)數(shù)均較對(duì)照組高，有顯著性差異(P＜0.01)。

10、實(shí)驗(yàn)組術(shù)后8周內(nèi)ROI平均計(jì)數(shù)為快速增長(zhǎng)期，術(shù)后8周開(kāi)始進(jìn)入緩慢增長(zhǎng)期，12周達(dá)到峰值。組織學(xué)觀察，實(shí)驗(yàn)組術(shù)后4周植入?yún)^(qū)內(nèi)CHA顆粒之間有島狀新生骨組織；術(shù)后8周植入?yún)^(qū)內(nèi)可見(jiàn)支架材料部分吸收，遺留空間被新生骨組織取代，骨缺損基本得到修復(fù)；術(shù)后12周可見(jiàn)明顯編織骨、板層骨及骨小梁形成，CHA大部分吸收，但仍可見(jiàn)到未吸收的HA顆粒。對(duì)照組術(shù)后4、8周無(wú)新生骨，術(shù)后12周有少量的新生骨。 4.組織工程化骨對(duì)植入體-骨界面骨整合的影響：

11、術(shù)后4、8、12周大體觀察與剖面觀察，見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組隨時(shí)間的延長(zhǎng)骨缺損得到修復(fù)，植入體周?chē)鸁o(wú)間隙。X線檢查見(jiàn)CHA顆粒吸收，被新生骨取代，植入體周?chē)鸀樾律?，植入體位置良好，而對(duì)照組植入體周?chē)饕獮楦呙芏鹊腃HA顆粒。生物力學(xué)結(jié)果示不同時(shí)間點(diǎn)植入體骨界面剪切強(qiáng)度較對(duì)照組增高(P＜0.01)。掃描電鏡觀察，可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組植入體表面孔隙內(nèi)無(wú)定形物質(zhì)隨時(shí)間的變化而逐漸增加。能譜分析術(shù)后4周實(shí)驗(yàn)組Ca、P元素百分含量較對(duì)照組增高，8、12周Ca元素百分含

12、量較對(duì)照組高(P＜0.05)，P元素百分含量與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異；Ca/P比值隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增高，于術(shù)后12周達(dá)2.02(P＜0.01)。不脫鈣骨組織學(xué)觀察，術(shù)后4周對(duì)照組植入體-骨界面為厚而疏松的軟組織，實(shí)驗(yàn)組界面為結(jié)締組織纖維膜，新生骨偶見(jiàn)；術(shù)后8周對(duì)照組植入體-骨界面為結(jié)締組織纖維膜，厚薄不一，界面較松，周?chē)梢?jiàn)少量新生骨組織，實(shí)驗(yàn)組界面有新骨沉積，植入體表面有部分點(diǎn)狀骨接觸；術(shù)后12周對(duì)照組植入體-骨界面為結(jié)締組織纖維膜，

13、界面有少量點(diǎn)狀骨接觸，實(shí)驗(yàn)組界面主要為骨組織，部分界面可見(jiàn)連續(xù)性骨接觸，甚至呈環(huán)形包繞。術(shù)后4周對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組植入體骨接觸率為0，術(shù)后8周、12周植入體骨接觸率均高于對(duì)照組(P＜0.01)。 5.rhBMP-2促進(jìn)組織工程化骨修復(fù)假體周?chē)侨睋p及假體-骨界面骨整合：術(shù)后3個(gè)月X線表現(xiàn)BMP組新骨生成明顯，CHA顆粒完全吸收，假體穩(wěn)定；細(xì)胞組有大量的新骨形成，但仍有CHA顆粒影，假體穩(wěn)定；對(duì)照組新骨生成不明顯，假體周?chē)型噶翈А?duì)

14、照組、細(xì)胞組、BMP組假體骨界面剪切強(qiáng)度無(wú)顯著性差異。不脫鈣骨組織學(xué)觀察，BMP組假體骨界面為骨組織充填，部分界面可見(jiàn)連續(xù)性骨接觸，僅見(jiàn)少量纖維組織，新生骨以成熟的板層骨為主，與假體結(jié)合緊密。細(xì)胞組假體骨界面主要為骨組織充填，可見(jiàn)較多的骨接觸，有部分纖維結(jié)締組織。對(duì)照組假體骨界面為纖維結(jié)締組織，邊緣有少量編織骨，骨接觸較少。圖形分析計(jì)算對(duì)照組、細(xì)胞組、BMP組假體界面骨接觸率(％)分別為15.47±8.05、38.78±19.40、67

15、.23±18.36(P＜0.01)。 結(jié)論： 1.本研究成功的分離、培養(yǎng)了兔骨髓MSCs，經(jīng)骨向誘導(dǎo)后表達(dá)高水平的ALP活性與Ⅰ型膠原，并能礦化細(xì)胞外基質(zhì)，證實(shí)已分化為成熟的成骨細(xì)胞。 2.骨髓MSCs骨向誘導(dǎo)后與CHA復(fù)合可修復(fù)植入體周?chē)少|(zhì)骨骨缺損，移植物血管化、骨代謝活性前8周為快速發(fā)展階段，8-12周進(jìn)入緩慢發(fā)展?jié)u趨成熟階段。 3.骨髓MSCs骨向誘導(dǎo)后與CHA復(fù)合修復(fù)植入體周?chē)侨睋p，促進(jìn)新骨生